In vitro and in vivo analysis of the functional significance of Tenascin-R and -C, CD24 and Semaphorin3A for neural stem cell behaviour and axonal pathfinding in Mus musculus (L.) 1758 and Rattus norvegicus (Berkenhout) 1769

Abstract

Extracellular cues play crucial roles in the orderly development and plasticity of the nervous system, as well as in processes leading to disease and controlling regeneration. A prominent group of the extracellular matrix represents the family of tenascins. Its members are involved in diverse functions such as cell migration, neurite growth, differentiation, axonal guidance and synaptic plasticity. Neural stem cells are the precursor cells of the nervous system. Their multipotentiality and capability for self-renewal disclosed the prospect for a therapeutic use in the treatment of degenerative brain disorders. The main aim of this work was to investigate the importance of the tenascins TNC and TNR for neural stem cell behaviour. By analyzing migratory activity, neurite growth and differentiation events of neural stem cells with the help of in vitro dissociated cell cultures and a newly established co-culture system of hippocampal organotypic slices with neural stem cells, evidence for an involvement of tenascins in neural stem cell development was found. Whereas TNR deficiency or ectopic expression by neural stem cells did not affect their development, TNC deficiency led to increased relative numbers of astrocytes after differentiation was induced and to reduced percentages of cells that could be detected within deeper layers of the slice tissue they had been applied to. Unexpectedly by constitutively expressing TNC, cell migration could not be further enhanced but resulted in decreased numbers of mature NeuN positive neurons whereas the number of young neuronally committed cells remained unchanged. Furthermore, indications for a modulation of the EGF receptor by TNC were found as its expression was prolonged or upregulated by differentiating stem cell cultures following increased TNC expression. Thus, TNC may indeed be important in modulating neural stem cell development by playing a role in regulating astrocytic numbers and in coordinating neuronal maturation or survival and migration. Contradictory results under different experimental conditions as well as the modulation of the EGF receptor expression further suggest that TNC exerts its function by orchestrated multiple interactions. Two further extracellular cues, Sema3A and CD24, both being implicated in neurite outgrowth and axonal guidance, were subject of a second study. Their expression at the sites of outgrowing corticospinal axons suggested a function in the correct pathfinding and timed outgrowth of the corticospinal tract. However, the examination of the tract in Sema3A and CD24 deficient mutant mice by in vitro and in vivo labelling methods using a fluorescent dye revealed no alterations of the timing and the pathfinding in the pons and at the level of the pyramidal decussation of corticospinal and corticopontine fibers.

Für die korrekte Entwicklung des Nervensystems, seine Plastizität aber auch in degenerativen Prozessen oder bei Regeneration spielen extrazelluläre Signalmoleküle eine entscheidene Rolle. Eine grosse Gruppe von Molekülen der extrazellulären Matrix stellen die Tenascine dar. Ihre Vetreter sind an unterschiedlichen Funktionen beteiligt, u.a. an Zellmigration, Neuritenwachstum, Differenzierung, axonaler Wegfindung und synaptischer Plastizität. Neurale Stammzellen sind die Vorläuferzellen des Nervensystems. Durch ihre Multipotentialität und die Fähigkeit sich selbst zu regenerieren eröffnete sich die Hoffnung auf eine therapeutische Anwendung in der Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Bedeutung der Tenascine TNC und TNR für das Verhalten von neuralen Stammzellen zu untersuchen. Durch Analyse von Migration, Neuritenwachstum und Differenzierung neuraler Stammzellen mit Hilfe von in vitro Kulturen von dissoziierten Zellen sowie einem neu-etablierten Co-Kultursystem, bestehend aus hippokampalen organotypischen Schnitten und neuralen Stammzellen, konnte eine Beteiligung von Tenascinen an der Entwicklung von neuralen Stammzellen gezeigt werden. Während TNR -Defizienz oder -ektopische Expression keinen Einfluss auf neurale Stammzellen hatte, führte das Fehlen von TNC zu einem Anstieg der Zahl der Astrozyten nachdem die Zellen zur Differenzierung angeregt wurden, und zu einer verringerten Zahl von Zellen, die innerhalb des Schnittegewebes detektiert werden konnten, auf das sie zuvor appliziert worden waren. Entgegen den Erwartungen konnte das Migrationsverhalten der Zellen durch eine konstitutive TNC Expression nicht weiter gesteigert werden und führte hingegen zu einer Reduktion ausgereifter NeuN positiver Neurone, während sich die Zahl junger unreifer Neurone nicht veränderte. Weiterhin konnten Hinweise auf eine Modulierung des EGF Rezeptors durch TNC gefunden werden, da erhöhte TNC Expression zu einer Verlängerung oder Steigerung dessen Expression führte. Durch Regulation der Astrozytenzahl und Koordination von neuronaler Reifung oder Überleben mit Migration könnte TNC eine wichtige Rolle für neurale Stammzellentwicklung spielen. Widerspüchliche Ergebnisse, die unter verschiedenen experimentellen Bedingungen erlangt wurden, sowie die Modulation der Expression des EGF Rezeptors legen weiterhin nahe, dass TNC seine Funktion durch konzertierte vielfältige Interaktionen ausübt. Zwei weitere extrazelluläre Signalmoleküle Sema3A und CD24, beide involviert in Neuritenwachstum und axonale Wegfindung, wurden in einer zweiten Studie untersucht. Da Sema3A und CD24 dort exprimiert werden, wo corticospinale Axone auswachsen, wurde vermutet, dass beide Moleküle bei korrektem zeitlichen Auswachsen und der Wegfindung des corticospinalen Trakts eine Rolle spielen. Die Untersuchungen des Trakts von Sema3A und CD24 defizienten Mausmutanten im Bereich der Pons und der pyramidalen Kreuzung durch in vitro und in vivo Färbemethoden mit Hilfe eines fluoreszierenden Farbstoffs ergaben jedoch keine Veränderungen von corticopontinen oder corticospinalen Fasern, weder in Hinblick auf das zeitliche Auswachsen noch in Hinlick auf eine korrekte Wegfindung.