Analyse und Bewertung potenziell spezifischer Promotoren auf ihre Eignung zur Anwendung in einem gentherapeutischen Ansatz bei der Behandlung des Osteosarkoms

Abstract

Zusammenfassung

In den letzten 25 Jahren hat sich die Prognose der Osteosarkompatienten mit Lungenmetastasen trotz neuer Therapieverfahren nicht entschieden verbessert. Ein neuer Ansatz könnte weniger durch die Modifizierung der Therapeutika, als durch den gezielten Angriff auf die Metastasen selbst durch Gentherapie geschaffen werden. Der Einsatz hyperaktiver Tumorsuppressorgene, die durch Viren in das Metastasengebiet eingebracht werden, birgt die Möglichkeit der lokalen Therapie; also die Expression therapeutischer Gene in Metastasen. Eine Fehlübertragung therapeutischer Gene in normale Gewebe könnte jedoch zu schweren lokalen und systemischen Nebenwirkungen führen. Daher sollte ein in viralen Vektoren eingebauter Promotor zwei Eigenschaften erfüllen: Zum einen Spezifität gegenüber Osteosarkomzellen, also Transkription des Transgens in den Metastasen und nicht im normalem Lungengewebe; und zum anderen Aktivität in OS-Zellen, also eine hohe Expressionsrate des Transgens. In der vorliegenden Arbeit wurden Promotoren, die in der Literatur als OS-, Tumor- oder Osteoblastenspezifisch beschrieben wurden und ein unspezifisches durch Doxycycline repremierbares Konstrukt (pAd.3r-luc.) auf ihre Eignung zur Anwendung in einem gentherapeutischen Ansatz bei der Behandlung des Osteosarkoms untersucht. Ihre Aktivität wurde in 5 OS-Zelllinien, einer Prostatakarzinomzelllinie und einer Lungenfibroblastenzelllinie mittels Dual-Luciferase-Reporter-assays gemessen. In allen Zelllinien konnte eine Aktivität der Promotorkonstrukte von unterschiedlicher Stärke gemessen werden. Der komplette OC-Promotor und der Bsp-Promotor konnten in OS-Zellen teilweise durch Vitamin D3 oder C induziert werden. Die Aktivität des hOC-Promotors war in der Prostatakarzinomzelllinie relativ gering und konnte nicht durch Vitamin D3 induziert werden. Das pAd.3r-luc.-Konstrukt konnte durch Doxycycline effektiv herrunterreguliert werden. Mit Ausnahme des ß-cat.-Promotors waren jedoch alle Promotoren in der Lungenfibroblastenzelllinie hochaktiv. Die in Bezug auf die Eignung der vorgestellten Promotorkonstrukte skeptischen Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Promotoren nicht erst in viralen Vektoren untersucht werden sollten, deren Konstruktion zeit-, arbeits- und kostenintensiv ist, sondern einen Schritt eher, also auf Ebene transienter Transfektionen mit Plasmiden. Wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist die Erkenntnis der möglichen Kombination zweier Promotorkonstrukte, bei denen ein durch den schwächeren, aber gewebespezifischen Promotor kontrolliertes Transgen-Produkt einen zweiten, hoch reaktiven Promotor, der das eigentliche therapeutische Transgen kontrolliert, zu einer hohen Expressionsrate anregt. Dies wäre durch die Kombination des pAd.3r-luc.-Konstruktes mit dem ß-cat.-prom., der zwar schwach, aber nicht in Lungebfibroblasten aktiv ist, denkbar.