Chlamydiaceae and Chronic Diseases : Clinical Implications and Host-Cell Gene Expression in a Model of Interferon-gamma-Induced Persistence

Abstract

Bacteria of the family Chlamydiaceae are obligate intracellular parasites of eukaryotic cells. Coronary artery disease and cerebro-vascular stroke are the most common causes of death worldwide. Chronic diseases like adult-onset asthma or atherosclerosis and trachoma are increasingly attributed to C. pneumoniae and C. trachomatis, respectively. Persistence of these organisms in its respective host is suspected to be the cause of these chronic diseases. In its persistent form, Chlamydiaceae most probably remain in a viable but culture-negative state, in which chlamydicidal drugs are apparently not effective. An improved understanding of the persistence mechanisms will be critical for the development of innovative therapeutic strategies to effectively treat chlamydially induced chronic diseases. In this thesis, the human pathogens C. trachomatis and C. pneumoniae, representing the two genera of the family Chlamydiaceae, were chosen to investigate their interrelationship with the host. To gain a better molecular understanding of the interaction between pathogen and host-cells, a comparative analysis of the gene expression pattern of HeLa-cells after active and IFN-gamma-induced persistent infection with C. pneumoniae was performed using Affymetrix® microchips (HG-U133A). The step towards in situ monitoring is often impeded by too small amounts of sample material. Traditional RNA amplification methods, based on the Eberwine protocol, are often self-limiting due to 3’-biased amplified RNA. New diagnostic tools will be necessary for sensitively detecting Chlamydiaceae during all stages of their developmental cycle and for monitoring chlamydicidal drug therapy. In this thesis, quantitative as well as qualitative CE-marked real-time PCR assays, detecting C. trachomatis DNA from swab, urine and sperm samples, were developed.

Bakterien der Familie Chlamydiaceae sind obligat intrazelluläre Parasiten eukaryotischer Zellen. Die koronare Herzkranzgefässerkrankung (KHK) und der ischämische Schlaganfall gehören weltweit zu den häufigsten Todesursachen. Chlamydien werden zunehmend mit chronischen Erkrankungen wie Bronchialasthma bei Erwachsenen und Atherosklerose im Falle von C. pneumoniae oder dem Trachom bei C. trachomatis assoziiert. Dies verstärkt den Verdacht, dass Chlamydien für mehrere Jahre in ihrem Wirt persistieren können und dadurch chronische Erkrankungen auslösen. Im Status der Persistenz liegen die Bakterien metabolisch und morphologisch verändert vor, sind nicht kultivierbar und scheinen mit heutigen Medikamenten nicht therapierbar zu sein. Um durch Chlamydien hervorgerufene chronische Erkrankungen behandeln und heilen zu können, wird die Entwicklung eines tieferen Verständnisses für den Ablauf und die Mechanismen der Persistenz erforderlich sein. In dieser Arbeit wurden die beiden human-pathogenen Erreger Chlamydia trachomatis und Chlamydophila pneumoniae stellvertretend für die beiden Genera (Chlamydia und Chlamydophila) der Familie der Chlamydiaceae untersucht. Um die Pathogenese besser zu verstehen und um Ansatzpunkte für mögliche Therapien chlamydialer Erkrankungen zu schaffen, wurden in dieser Arbeit Affymetrix® Microarrays (HG-U133A) verwendet und die Genexpression von epithelialen HeLa-Zellen nach Infektion mit C. pneumoniae vergleichend analysiert. Der Wechsel von in vitro zu in vivo Modellen gestaltet sich jedoch schwierig, da für Microarray Untersuchungen nicht genügend Untersuchungsmaterial zur Verfügung steht. Herkömmliche RNA Amplifikationsmethoden, die auf dem James Eberwine Verfahren basieren, sind oft selbstlimitierend durch unvollständig amplifizierte RNA. Ein Teilprojekt dieser Arbeit war es deshalb, den Einsatz einer neuen linearen RNA Amplifikationstechnik für C. pneumoniae Persistenz-Studien zu überprüfen. Zusätzlich sind neue diagnostische Anwendungsverfahren notwendig, die es erlauben, Chlamydien während ihres gesamten Entwicklungszyklus hoch sensitiv nachzuweisen und damit den Therapieverlauf zu überwachen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden CE-markierte qualitative und quantitative real-time PCR Assays für den Nachweis von C. trachomatis DNA aus Abstrich-, Urin- und Sperma-Proben entwickelt.