Expression and distribution of Kir3.2 binding partners

Abstract

The subject of the present study was an examination of putative concurrence of Kir3.2, FILIP, and MUPP1 expression and distribution in the mouse model. Previous studies proposed that the neuronal cell adhesion molecule NCAM regulates the surface delivery of Kir3.2 via a common binding partner, shared by Kir3.2 and NCAM. Two putative Kir3.2 binding partners were found in a Yeast Two-Hybrid screening system: FILIP and MUPP1. Since co-expression in the same cell is the minimal requirement for Kir3.2/FILIP and Kir3.2/MUPP1 interaction, Western Blot analysis, In Situ hybridization, and Immunohistochemistry of these three molecules were performed and compared to define regions of putative co-expression. This study is the first to demonstrate that the potassium channel Kir3.2 and the PDZ protein MUPP1 are co-expressed in the brain on both the mRNA and protein level during embryogenesis and in the adult mouse and can thus possibly interact with each other. PDZ proteins are protein-protein interaction modules that are involved in the assembly of supramolecular complexes and also in the trafficking of these interaction partners. Since further studies were able to additionally show an interaction between MUPP1 and NCAM, we now propose that MUPP1 may present the missing link to understanding the way in which NCAM regulates cell surface localization of Kir3.2. This study also characterizes FILIP mRNA and protein distribution during embryogenesis and in the adult mouse. It was the first to show that FILIP mRNA and protein are expressed in the adult cortex. Furthermore, this study provides a first insight into the coexpression of potassium channel Kir3.2 and the Filamin A interacting protein FILIP on both mRNA and protein level in different tissues and brain regions during embryogenesis and in the adult mouse. FILIP is a negative regulator of Filamin A, inducing Filamin A degradation processes. Since Filamin A is the most potent actin cross-linker, it was suggested that FILIP play a role in the regulation of cell migration, especially in the cortex. Besides this, no other function such as membrane trafficking has been assigned to FILIP. The putative physiological relevance of this interaction remains to be elucidated in further studies.

In der vorliegenden Arbeit wurden die Expression und Verteilung der Proteine Kir3.2, FILIP und MUPP1 untersucht. Auf Grund von früheren Studien der Arbeitsgruppe wurde postuliert, dass das neuronale Zelladhäsionsmolekül NCAM den Transport von Kir3.2 zur Zelloberfläche mit Hilfe eines gemeinsamen Bindungspartners von NCAM und Kir3.2 reguliert. Der daraufhin durchgeführte Yeast Two Hybrid Screen ergab zwei potentielle Bindungspartner für Kir3.2: FILIP und MUPP1. Für weiterführende Arbeiten ist es notwendig zu untersuchen, inwieweit sich die Expressionsmuster von Kir3.2 mit den beiden Bindungspartnern überlappen, da eine grundlegende Voraussetzung für die Interaktion zwischen Kir3.2/FILIP und Kir3.2/ MUPP1 die Co- Expression dieser Proteine in der gleichen Zelle ist. Daher haben wir In situ -Hybridisierungen, Western Blot- und Immunhistochemie- Experimente von diesen drei Molekülen angefertigt und miteinander verglichen, um die Frage einer möglichen Co- Expression klären zu können. Im Rahmen dieser Studie konnte erstmalig gezeigt werden, dass der Kalium-Kanal Kir3.2 und das PDZ Protein MUPP1 während der Embryogenese und in der adulten Maus in verschiedenen Geweben sowohl auf mRNA- als auch auf Protein- Ebene co-exprimiert werden. PDZ Proteine sind Protein-Protein Interaktionsmodule, die supramolekulare Proteinkomplexe formen, jedoch auch an dem intrazellulären Transport der interagierenden Proteine beteiligt sind. Da weitere Versuche unserer Arbeitsgruppe in der Lage waren, eine Interaktion zwischen MUPP1 und NCAM zu zeigen, postulieren wir somit MUPP1 als das gesuchte Bindeglied zwischen NCAM und Kir3.2. Die vorliegende Arbeit charakterisiert des Weiteren die Verteilung der FILIP mRNA und des Proteins während der Embryonalentwicklung und in der adulten Maus. So war es erstmals möglich zu zeigen, dass die FILIP mRNA und Protein im adulten Kortex exprimiert werden. Diese Arbeit ermöglicht weiterhin einen ersten Einblick in die Co- Expression von Kir3.2 und FILIP während Embryogenese und in verschiedenen Geweben im adulten Tier sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene.FILIP induziert den Abbau von Filamin A, einem zytoskelettassoziierten Protein, welches das für die Zellmotilität unabdingbare Aktin quervernetzt. FILIP wird daher eine Rolle bei der Regulation von Zellmigration z.B. im Kortex zugesprochen. Andere Funktionen von FILIP, wie beispielsweise bei der Regulation des intrazellulären Transports von Proteinen, wurden bislang nicht beschrieben. Die potentielle physiologische Relevanz dieser Interaktion bleibt daher offen für weitere Studien.