Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen zu Chondrozyten

Abstract

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines Verfahrens zur chondrogenen Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark. Dazu wurde ein so genanntes Drei-Phasen-Modell entworfen, das die zeitliche Trennung und separate Stimulierung der drei wesentlichen Prozesse - Proliferation, Differenzierung und Matrix-Synthese ermöglicht. Zur Gewinnung einer für dieses Vorhaben geeigneten Zellpopulation aus dem Knochenmark wurde ein Verfahren zur Anreicherung schnell proliferierender und damit nur in geringem Maße differenzierter Progenitorzellen entwickelt. Zur Überwachung der Zellqualität wurden verschiedene Methoden der Durchfluss-Zytometrie eingesetzt. Die Differenzierung der Zellen erfolgte nach reversibler Einbettung in ein Gel, um durch Vermeidung von Zell-Zell-Kontakten eine vorzeitige Initiierung der Matrixbildung zu verhindern. Die Unterstützung des Differenzierungsprozesses durch Wachstumsfaktoren wie IGF-I, TGF-ß3 und Dexamethason wurde durch Messung der Matrixbildung und der Genexpression von Kollagen Typ I, II und X verifiziert. Der Nachweis des Erfolges der quantitativen Differenzierung gelang durch immunhistologische Anfärbung des Kollagens Typ VI, eines hochspezifischen Markers für Chondrone. Zur funktionellen Verifizierung der Differenzierung der hMSCs zu reifen Chondrozyten wurde die von den Zellen in einer dreiwöchigen Pellet-Kultur gebildete Matrix hinsichtlich der gebildeten Glykosaminoglykane und der Exprimierung einiger für hyalinen Knorpel charakteristischen Gene analysiert. Dabei wurde festgestellt, dass nach Optimierung der Bedingungen, unter anderem der Weglassung von TGF-ß3 oder Dexamethason aus dem Kulturmedium, ein für den hyalinen Knorpel typisches Expressionsmuster erreicht werden konnte. Während die Bildung von mRNA des Kollagens Typ II stark stimuliert werden konnte, blieb die von Kollagen Typ I und X auf niedrigem Niveau. Die Ergebnisse konnten durch immunhistologische Analysen von Paraffinschnitten bestätigt werden. Auch hier konnten Bedingungen ermittelt werden, unter denen Kollagen Typ II und VI vermehrt gebildet wurden, während Kollagen Typ I unterhalb der Nachweisgrenze blieb. Gemessen an diesen Parametern übertrifft die Qualität des mit dem Drei-Phasen-Modell hergestellten Knorpels bei weitem diejenige, die von anderen Autoren bisher mit dem Differenzierungsmodell der Pellet-Kultur erreicht werden konnte. Die vergleichende Analyse der Genexpression wichtiger Genmarker des Knorpels sowie immun-histologische Vergleiche der in vitro hergestellten Knorpelprobe mit nativem Knorpel führen zu dem Schluss, dass das entwickelte Drei-Phasen-Modell eine sehr gute Chance für den Einsatz von hMSCs aus dem Knochenmark zur Herstellung von Knorpel-Implantaten für die Therapie von Gelenkflächenschäden darstellt.