Volltextdatei(en) vorhanden
DC ElementWertSprache
dc.contributor.advisorMeyer, Bernd (Prof. Dr.)
dc.contributor.authorAxmann, Marco
dc.date.accessioned2020-10-19T12:19:46Z-
dc.date.available2020-10-19T12:19:46Z-
dc.date.issued2007
dc.identifier.urihttps://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/1750-
dc.description.abstractAufbauend auf den von R. Meinecke durchgeführten Bindungsstudien des Peptids cyclo(RGDfV) an das membranständige Rezeptorprotein Integrin alphaIIbbeta3 in lebenden Thrombozyten, wurde in dieser Arbeit eine Methode entwickelt, die die direkte Beobachtung der Bindung des Peptids an das Membranprotein erlaubt. Das neue Verfahren basiert auf der saturation transfer difference (STD) NMR-Spektroskopie und beinhaltet einen weiteren Differenzfilter. Es wird daher als saturation transfer double difference (STDD) NMR-Spektroskopie bezeichnet. Die für die NMR-Experimente nötigen Zellsuspensionen wurden aus Thrombozytenkonzentraten präpariert und auf zwei NMR-Röhrchen aufgeteilt, zu einer der Proben der Ligand hinzugegeben und anschließend von beiden Suspensionen möglichst zeitnah hintereinander ein STD NMR-Spektrum aufgenommen. Anschließend wurde das prozessierte STD-Spektrum der Probe mit nur Zellsuspension von dem Spektrum der Probe, die die gleiche Zellsuspension plus den Liganden enthielt, abgezogen. Es resultierte das STDD-Spektrum, in dem fast ausschließlich STD-Signale des Liganden cycloRGDfV zu beobachten waren. Sämtliche störenden Signale konnten auf diese Weise erfolgreich eliminiert werden, so dass die Bestimmung des Bindungsepitops des Peptids zugänglich war. Das gefundene Epitop bestätigte die Ergebnisse von R. Meinecke, zeigte jedoch einen etwas veränderten Bindungsmodus von cycloRGDfV an Integrin in Thrombozyten als an das Protein, eingebettet in Liposomen. Darüber hinaus wurde für das native Protein in den Zellmembranen eine gesteigerte Aktivität beobachtet. Das hier entwickelte STDD-Experiment ist von großer Bedeutung, da es eine direkte Beobachtung von Ligandbindung an membranständige Rezeptoren in lebenden Zellen erlaubt. Das SARS Coronavirus (SARS-CoV) ist der Erreger des Schweren Akuten Atemwegssyndroms (SARS). Für die Infektion vermittelt die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) des viralen S-Proteins den ersten Kontakt des Virus zum humanen Rezeptor, dem angiotensin converting enzyme 2 (ACE2). In dieser Arbeit sollte das Bindungsepitop der RBD mit Hilfe der SPR-Technik sowie der STD NMR-Spektroskopie auf molekularer Ebene untersucht werden. Das Ziel der Bindungsstudien war die Identifizierung einer Leitstruktur, die als Grundlage für die Entwicklung von entry-Inhibitoren der SARS-CoV Infektion dienen sollte. Es wurde zunächst eine Peptidbibliothek synthetisiert, die sechzehn Dodecapeptide enthielt, die die Sequenz der RBD in direkter Abfolge wiedergeben. Die gereinigten Peptide wurden anschließend in einem SPR-Assay auf eine Affinität gegenüber ACE2 untersucht. In diesem ersten screening konnten die drei Peptide 11 (Y438-R449), 14 (S474-T485) und 15 (T486-V497) als bindende Liganden identifiziert werden, wobei Verbindung 11 mit einem KD von 85 µM im Vergleich zu 14 (KD = 450 µM) und 15 (KD =670 µM) die stärkste Affinität zu ACE2 zeigte. Eine detaillierte Untersuchung dieser Sequenzen wurde mit einer zweiten Bibliothek mit insgesamt vierzehn Hexapeptiden durchgeführt. Die SPR-Bindungsstudien dieser Verbindungen identifizierte Peptid 18 (Y438-L443, YKYRYL) mit einer Dissoziationskonstanten von 46 µM als eindeutig besten Liganden. Das STD NMR Bindungsepitop des Peptids 18 zeigt große Nähe der Tyrosine Y438, Y440, Y442 sowie von R441 zum Rezeptor. Damit eine Verbindung als potentielle Leitstruktur für die Entwicklung von entry-Inhibtoren in Frage kommt, ist es notwendig, dass sie biologisch aktiv und tatsächlich in der Lage ist, um die virale Bindungsstelle zu konkurrieren. Die Aktivität von 18 wurde in Form eines real-time RT-PCR-Reduktionsassays in VeroE6 Zellen untersucht und zeigte bei einer Peptidkonzentration von etwa 10 mM eine vollständige Reduktion der Virusreplikation. Die biologischen Testergebnisse lassen den Schluss zu, dass Verbindung 18 (Y438-L443, YKYRYL) die entscheidende Bindungsstelle für das Virus auf dem Rezeptor ACE2 blockiert und eine Infektion der Zellen durch SARS-CoV verhindert. Ein zytotoxischer Effekt konnte nicht beobachtet werden. Ferner wurde das so genannte Fusionspeptid 31 (IGYQ-GSGS-NYNYKYRYL) modelliert und anschließend synthetisiert. Die Verknüpfung beider Epitope konnte durch den gewählten GSGS-linker erfolgreich realisiert werden und im SPR-Experiment zeigte Peptid 31 mit einer Dissoziationskonstanten von 18 µM etwas stärkere Wechselwirkungen mit ACE2 als die postulierte Leitstruktur 18. Im abschließenden Teil dieser Arbeit wurde eine dritte Peptidbibliothek synthetisiert, mit dem Ziel, den Einfluss der Aminosäuren R441, Y438, Y440 und Y442 zu untersuchen. Es sollten dabei Peptidanaloga der Leitstruktur 18 identifiziert werden. Es zeigte sich, dass bei der Mutation R441Cit die Bindung zu ACE2 erlischt. Die Substitution von Y438, Y440 und Y442 durch Tryptophan, Benzoylphenylalanin bzw. Cyclohexylalanin führte bei teilweise gleich bleibender Bindungsaffinität zu einer potentiell höheren Stabilität gegenüber Proteasen.de
dc.description.abstractOn the basis of R. Meinecke´s binding studies of the pentapeptide cycloRGDfV to the surface glycoprotein integrin alphaIIbbeta3 of human blood platelets, a new method was developed to detect the binding of the peptide to the membrane-bound protein in living cells. The new technique is a further development of the saturation transfer difference (STD) NMR experiment as it implies a second difference filter and therefore is called saturation transfer double difference (STDD) NMR spectroscopy. Cell suspensions necessary for the NMR experiments were prepared from human platelet concentrates and split up into two NMR tubes, to one tube ligands were added and STD spectra of both samples were recorded one after the other. The STD spectrum of the sample containing only the cell suspension was then subtracted from the STD spectrum of the cell suspension with additionally added ligands. This resulted in the STDD spectrum which revealed mainly signals from the ligand receptor interaction. Thus, all the disturbing signals could be canceled out and an assignment of the ligand´s signals as well as an epitope mapping of cycloRGDfV became easily possible. The binding epitope is largely in agreement with the data found by R. Meinecke for the interaction with the intergrin embedded in liposomes but reflects a slightly different binding mode to the native receptor integrated in platelet membranes compared to integrin reintegrated into liposome membranes. In addition, a higher activity was found for the native integrin, leading to STD effects larger in their intensity when compared to the studies with integrin in liposome membranes. This shows the importance of the new STDD technique which allows a direct observation of ligand binding to membrane proteins in their natural environment, i.e. in living cells. The SARS coronavirus (SARS-CoV) is the agent of severe acute respiratory syndrome (SARS). As initial interaction of the SARS-CoV infection a defined receptor-binding domain (RBD) on the viral S-protein mediates the attachment of the virus to its cellular receptor, angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2). In this work the binding epitope of the RBD was characterized in detail by means of the SPR technique and STD NMR spectroscopy. The intention of the binding studies was to identify a lead structure as a basis for the design of entry inhibitors of the virus infection. As a start a linear peptide library was synthesized containing sixteen 12mer peptides which together comprised the residues of the RBD. The purified peptides were used to identify binding motifs with the human receptor ACE2 in a SPR affinity assay. In this first screening the three compounds 11 (Y438-R449), 14 (S474-T485) and 15 (T486-V497) were identified as binding ligands, whereas peptide 11 clearly showed the strongest binding with a dissociation constant of KD = 85 µM, compared to 14 (KD = 450 µM) and 15 (KD =670 µM). To further characterize the binding epitope a second peptide library of fourteen 6mer peptides was synthesized. A SPR screening clearly identified peptide 18 (Y438-L443, YKYRYL) with a dissociation constant of 46 µM as best binding ligand. The binding epitope of 18 was also characterized by STD NMR spectroscopy and showed close contact to the receptor for residues Y438, Y440, Y442 as well as R441 . A chemical compound can only be considered as a lead structure, if it shows biological activity and therefore is capable to compete with the binding site of the virus. The biological properties of 18 were studied in a real-time RT-PCR reduction assay in VeroE6 cells. At a concentration of 10 mM a complete reduction of virus replication was observable indicating truly that the identified lead structure 18 blocks the critical binding site on the receptor molecule ACE2 and an infection of the cells becomes impossible for the SARS-CoV. There was no indication for a cytotoxic effect of the compound. In the further course of this work the so-called fusion peptide 31 (IGYQ-GSGS-NYNYKYRYL) was at first modeled in silico and then synthesized. The linkage could be realized successfully by an GSGS-linker. In the SPR experiment peptide 31 showed a dissociation constant of 18 µM, which indicates a slightly stronger interaction with the receptor ACE2 than ligand 18. In the concluding part of the work another peptide library was synthesized in order to study the influence of the residues R441, Y438, Y440 and Y442 on the binding affinity. The aim of the following binding assays was to identify analog peptides with stronger affinity towards ACE2 and a potentially higher stability towards proteases. The mutation R441Cit abolished the binding of the compound. The substitution of the tyrosine residues Y438, Y440 and Y442 with tryptophan, benzoylphenylalanine or cyclohexylalanine lead to potentially higher stability towards proteases at similiar binding affinity of the analog peptides to the receptor ACE2.en
dc.language.isodede
dc.publisherStaats- und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky
dc.rightshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2
dc.subjectProtein-Ligand-Wechselwirkungende
dc.subjectSTDD NMRde
dc.subjectMembranproteinede
dc.subjectSPR screeningde
dc.subjectdrug designen
dc.subjectentry-inhibitoren
dc.subjectpeptideen
dc.subjectlead structureen
dc.subjectligand bindingen
dc.subject.ddc540 Chemie
dc.titleProtein-Ligand-Wechselwirkungen im Wirkstoffdesign : Ligandbindung an membranständige Proteine in lebenden Zellen und die Identifizierung einer Leitstruktur als entry-Inhibitor der SARS-CoV Infektionde
dc.title.alternativeProtein-ligand-interaction in the drug design process : Ligand binding to membrane-bound proteins in living cells and the identification of a lead structure as an entry-inhibitor of the SARS-CoV infectionen
dc.typedoctoralThesis
dcterms.dateAccepted2007-05-25
dc.rights.ccNo license
dc.rights.rshttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
dc.subject.bcl33.07 Spektroskopie
dc.subject.bcl35.50 Organische Chemie: Allgemeines
dc.subject.bcl35.62 Aminosäuren, Peptide, Eiweiße
dc.subject.bcl35.70 Biochemie: Allgemeines
dc.subject.gndNMR-Spektroskopie
dc.subject.gndSARS
dc.subject.gndPeptid-Bindung
dc.subject.gndInhibitor
dc.subject.gndArzneimitteldesign
dc.subject.gndCoronaviren
dc.type.casraiDissertation-
dc.type.dinidoctoralThesis-
dc.type.driverdoctoralThesis-
dc.type.statusinfo:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.thesisdoctoralThesis
tuhh.opus.id3319
tuhh.opus.datecreation2007-06-04
tuhh.type.opusDissertation-
thesis.grantor.departmentChemie
thesis.grantor.placeHamburg
thesis.grantor.universityOrInstitutionUniversität Hamburg
dcterms.DCMITypeText-
tuhh.gvk.ppn54558860X
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:18-33190
item.advisorGNDMeyer, Bernd (Prof. Dr.)-
item.grantfulltextopen-
item.languageiso639-1other-
item.fulltextWith Fulltext-
item.creatorOrcidAxmann, Marco-
item.creatorGNDAxmann, Marco-
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen
Dateien zu dieser Ressource:
Datei Beschreibung Prüfsumme GrößeFormat  
Dissertation_Axmann_print.pdf71a1dfeda97052fdd61dfdb9af9758b68.48 MBAdobe PDFÖffnen/Anzeigen
Zur Kurzanzeige

Diese Publikation steht in elektronischer Form im Internet bereit und kann gelesen werden. Über den freien Zugang hinaus wurden durch die Urheberin / den Urheber keine weiteren Rechte eingeräumt. Nutzungshandlungen (wie zum Beispiel der Download, das Bearbeiten, das Weiterverbreiten) sind daher nur im Rahmen der gesetzlichen Erlaubnisse des Urheberrechtsgesetzes (UrhG) erlaubt. Dies gilt für die Publikation sowie für ihre einzelnen Bestandteile, soweit nichts Anderes ausgewiesen ist.

Info

Seitenansichten

894
Letzte Woche
Letzten Monat
geprüft am 27.03.2024

Download(s)

1.670
Letzte Woche
Letzten Monat
geprüft am 27.03.2024
Werkzeuge

Google ScholarTM

Prüfe