Untersuchungen zur Dysregulation und Funktion von Mitgliedern der CEACAM-Genfamilie im humanen Kolon

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von CEACAM1 und CEACAM5 im Kolongewebe, insbesondere in frühen Veränderungen der humanen Kolonmukosa nachgewiesen. Die festgestellten Veränderungen der Gewebeexpression von CEACAM1 führten zu einer detaillierten Untersuchung eines möglichen Einflusses von CEACAM1 auf Prozesse zur Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase. In in vitro Modellen wurden einzelne Schritte des zu Apoptose führenden Signaltransduktionsweges von CEACAM1 bei Bindung eines extrazellulären Liganden an Zellkultur-Modellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von CEACAM1 bereits in 72% der ACF und durchschnittlich 65% der hyperplastischen Polypen deutlich vermindert ist. Dieser Verlust geht der bekannten Dysregulation von CEACAM1 in Adenomen und Karzinomen voraus und ist die erste Beschreibung für eine CEACAM1-Dysregulation in Vorläuferläsionen der Kolonmukosa. Die Verminderung der Expression ist auf CEACAM1 beschränkt und erstreckt sich nicht auf andere, regulär im Kolon exprimierte Mitglieder der CEACAM-Familie. Eine parallel am gleichen Gewebekollektiv durchgeführte, histochemische Untersuchung von Proliferation und Apoptose zeigte einen signifikanten Zusammenhang zwischen dem Verlust von CEACAM1 und einem Absinken der Apoptoserate in der gleichen Gewebeprobe (p < 0,05). Zum Nachweis eines kausalen Zusammenhanges zwischen dem Verlust der CEACAM1-Expression und der Verminderung der Apoptoserate wurden zwei Zellkultursysteme etabliert. Untersucht wurde in diesen Systemen vor allem die Relevanz der langen Spleißvariante von CEACAM1-4L. In einem ersten Ansatz wurden CEACAM1-L transfizierte Jurkat-Zellen mit CEACAM1-spezifischen Liganden (CEACAM1-spezifische Antikörper) quervernetzt. Quervernetzung von CEACAM1-L auf der Zelloberfläche führte zu einer spezifischen Erhöhung des Anteils apoptotischer Zellen um 25% in den untersuchten Kulturen. In einem zweiten Modell wurden an der humanen Kolonepithelzelllinie HT29 zunächst Stimuli ermittelt, die eine Modulation der CEACAM1-Expression in diesen Zellen ermöglichten. Neben dem Zytokin Interferon-g wurde auch die Wirkung von kurzkettigen Fettsäuren auf die Expression von CEACAM1 untersucht. Die Wirkung der Fettsäuren erfolgte hierbei auf der Ebene der Histonmodifikation durch Acetylierung, was die erfolgreiche Induktion der CEACAM1-Expression durch Zusatz des Histondeacetylase-Inhibitors Trichostatin A zum Zellkulturmedium mit nachfolgenden Expressionsanalysen in quantifizierenden Western Blots und real-time qRT-PCR eindeutig zeigte. Nach Steigerung der CEACAM1-Expression und Vernetzung von CEACAM1 auf der Zelloberfläche wurde eine Zunahme des Anteils apoptotischer Zellen in den Zellkulturen festgestellt. Somit konnte ein Zusammenhang zwischen der CEACAM1-Expression und der Apoptose gesichert werden. Als möglicher physiologischer Ligand wurde CEACAM5 (CEA) identifiziert, ein Protein dass im Kolongewebe neben der GPI-verankerten membrangebundenen Form auch in einer im Mukus enthaltenen, löslichen Form vorkommt. Die Untersuchung des Apoptosesignalweges zeigten die Aktivierung von Caspase-3 und Caspase-1 durch Vernetzung von CEACAM1 auf der Zelloberfläche. Die Zugabe von Caspase-3 und Caspase-1 Inhibitoren verhinderte die Auslösung der CEACAM1-induzierten Apoptose. Die primäre Beteiligung des intrinsischen Apoptosesignalweges mit Beteiligung der Mitochondrien konnte ausgeschlossen werden (JC-1 Färbungen, Cytochrom c und Caspase-9 Analysen). CEACAM1 unterliegt selber einer Prozessierung im Verlauf der Apoptose. Es tritt eine Spaltung von CEACAM1-L in der langen zytoplasmatischen Domäne auf, zusätzlich wurde zumindest eine weitere Spaltung im extrazellulären Anteil des CEACAM1 belegt. Diese Spaltung tritt unabhängig vom Apoptosestimulus auf. Die Expression von CEACAM1-4L als N-terminal FLAG markiertes Fusionsprotein führte zur Identifizierung eines etwa 12,7 kD grossen, extrazellulär abgespaltenen Fragmentes. Zusammenfassend zeigt die Arbeit das Potential des Zelladhäsionsmoleküls CEACAM1 zur Induktion von Apoptose und somit indirekt eine Einflussnahme auf die Regulation des Gewebeturnovers in der normalen Kolonmukosa.