Charakterisierung eines adenoviralen Vektors mit cholesterinregulierter LDL-Rezeptor Expression

Abstract

In der gentherapeutischen Therapie der familiären Hypercholesterinämie wurden Adenoviren eingesetzt, die den LDL-Rezeptor exprimieren können. Bei der Wahl der Promotoren zur Expression des LDL-Rezeptors wurden bis dahin konstitutive Promotor eingesetzt. Diese führten zu kristallinen Cholesterinablagerungen in den Zielzellen. Um dieses Problem zu beheben, wurde ein cholesterinrgulierter Promoter (P-600ap) humaner Herkunft entwickelt, der eine überschießende zellschädigende Expression verhindern soll. Der Vergleich des humanen cholesterinregulierten Promoters im Vektor Ad-P-600aphLDLR soll mit dem konstitutiven Promoter des Rous sarcoma Virus im Vektor Ad-RSV hLDLR verglichen werden. Es soll weiterhin überprüft werden, ob der neu entwickelte Vektor in der Lage ist, eine Expression des LDL-Rezeptors in einer Höhe zu erreichen, die eine Anwendung im gentherapeutischen Bereich möglich macht. Die Testung und der Nachweis der Expressionsstärke von LDL-Rezeptoren sollen nach Expression in Zellkulturen erfolgen. Vortestungen der Virenkonstrukte an Mäusen sollten ergänzend durchgeführt werden. Hierzu dienen einerseits Wildtypmäuse um die Applikationsart zu testen und die Dosisanpassung zu optimieren, andererseits LDL-Rezeptor Knock-out Mäuse, um schon eventuelle Effekte auf dem Niveau der Lipidkonstellation im Serum sichtbar zu machen bzw. immunhistochemische Gewebenachweise zu führen. Um Promotoren vergleichen zu können, müssen die genauen Titer der Virenpräparationen bekannt sein. Um dies zu erreichen werden konventionelle Methoden wie die TCID-Titerbestimmung eingesetzt. Als neuartige Methode der genauen Quantifizierung soll eine Real-Time PCR entwickelt werden. Es sollte die Frage geklärt werden, ob ein infektiöser Titer mit Hilfe der quantitativen PCR (Real-Time PCR) ermittelt werden kann und welche Bedingungen dabei erfüllt werden müssen. In diesem Zusammenhang galt es, Untersuchungen zum Mechanismus der Aufnahme von Virus in die Zelle zu machen. Hierbei wurden Viren mit Fluorophoren markiert, sowie deren Weg zum Zellkern mittels konfokaler Mikroskopie sichtbar gemacht. Die hieraus gewonnenen Ergebnisse sollen dann, zur Absicherung des Titers von Ad-P-600aphLDLR und Ad-RSV hLDLR dienen und die Frage nach der Möglichkeit einer Anwendung des neuentwickelten Vektors Ad-P-600aphLDLR für gentherapeutische Zwecke klären.

Genetherapie is a way to combat familial homozygot hypercholesterinämia. Adenovirus is an often used vector to transfer the information of the lost LDL-receptor. constitutive promoters showed an toxic increase of cholesterol in target cells. By the choice of a human promoter(P-600ap) the sideeffects should be avoided. The testing of this construct in cell-system and LDR-R -/- mice shows the genetherapeutic potence of this new vector. Also a new method for measuring the infectious titer of adenovirus by quantitative real time pcr is developed. To demonstrate this infectional titer, fluorophor labeled vectors are prepared, visualised by confacal microskopy, diameter measured by dynamic light scattering, and infectious viral DNA measured after nuclear core preparation.