Ein dupliziertes Gen aus Leishmania infantum (Nicoll, 1908) vermittelt Resistenz gegen Miltefosin und Antimon

Abstract

Leishmanien sind einzellige Parasiten, die beim Menschen unterschiedliche Krankheitsformen hervorrufen. Dabei stellt die viszerale Leishmaniase (VL) die schwerwiegendste Form dar, die unbehandelt zum Tod führt. Impfstoffe gegen die VL sind nicht vorhanden, ebenso wenig ist eine medizinische Prophylaxe möglich. Eine erfolgreiche Therapie mit den wenigen vorhandenen Medikamenten wird immer mehr durch die zunehmende Resistenzentwicklung beeinträchtigt. Miltefosin, ein neu entwickeltes Medikament, ist seit Ende 2002 zur Behandlung von VL in Indien zugelassen. Die Wirkungsmechanismen des Medikamentes sind zum größten Teil noch unbekannt. Es besitzt eine lange Halbwertszeit im Gewebe, und es konnten bereits Miltefosin-resistente Leishmania-Stämme in vitro selektiert werden. Aus diesem Grund wird in naher Zukunft auch mit dem Auftreten von klinischer Miltefosin-Resistenz gerechnet. In der vorliegenden Arbeit sollten daher genetische Marker in Leishmania infantum, dem Erreger der VL, identifiziert und charakterisiert werden, die mit Miltefosin-Resistenz korrelieren. Dies erfolgte mit Hilfe der funktionellen Komplementation. Leishmania infantum Wildtyp (Li WT) Promastigoten (Insektenstadium des Erregers) wurden mit einer L. infantum Cosmid-Genbank transfiziert. Rekombinante Promastigoten wurden einer Selektion mit Miltefosin unterzogen. Die Selektion von Miltefosin-resistenten Leishmanien beruht dabei auf der Überexpression von Genen, die sich auf bestimmten Cosmiden befinden, und den Parasiten ein Überleben unter hohen Miltefosin-Konzentrationen ermöglichen. Nach zwei aufeinander folgenden Selektionsrunden dominierten zwei Cosmidtypen, die als pcosM1 und pcosM2 bezeichnet wurden (M=Miltefosin). L. infantum-Zellen, die mit den Cosmiden pcosM1 und pcosM2 transfiziert wurden (Li [pcosM1] und Li [pcosM2]), zeigten einen ca. 3-fach erhöhten IC50-Wert (inhibition concentration) für Miltefosin. Dabei zeigte Li [pcosM2] die stärkste Resistenz. Zur Identifizierung des Gens bzw. der Gene, die für die Miltefosin-Resistenz verantwortlich sind, wurden Sequenzanalysen beider Cosmide durchgeführt. Die Analyse ergab, dass die inserts von pcosM1 und pcosM2 überlappende Sequenzen besitzen. Sie überlappen in nur einem offenen Leserahmen, das für ein putatives 300 kDa Protein unbekannter Funktion kodiert. Die gezielte Überexpression des P300-Gens führte in L. infantum zu einer deutlichen Erhöhung des IC50-Werts für Miltefosin. P300 wurde als das Miltefosin-Resistenz vermittelnde Gen identifiziert. Makrophagen-Infektionsexperimente haben gezeigt, dass P300 auch in intrazellulären Amastigoten (Säugetierstadium des Erregers) Miltefosin-Resistenz vermittelt. Die Überexpression von P300 führte zur Kreuzresistenz gegenüber dreiwertigem Antimon, einem klassischen anti-Leishmania Wirkstoff. Dagegen konnte keine Resistenz der rekombinanten Parasiten gegenüber Pentamidin beobachtet werden, welches häufig bei Antimon-resistenten Fällen zum Einsatz kommt. Ausgedehnte Datenbankrecherchen zur Charakterisierung des P300-Genprodukts lieferten keine Informationen. Um Hinweise auf eine mögliche biologische Funktion des 300 kDa Protein zu erhalten, wurde eine Deletionsmutante (LiP300-/-) hergestellt. Diese Mutante zeigte eine deutlich erhöhte Sensitivität gegenüber Miltefosin im Vergleich zum Wildtyp. Die episomale Rückführung des Gens führte zur Wiederherstellung des WT-Phänotyps. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass bei LiP300 -/- die Teilungsrate in der spätlogarithmischen Wachstumsphase geringer ist als beim Li WT. Hinsichtlich der Morphologie, der Makrophageninfektiösität und der Antimon-Toleranz konnten jedoch keine Veränderungen des Phänotyps von LiP300 -/- festgestellt werden. Mit Hilfe der funktionellen Komplementation wurde ein Gen isoliert, welches durch Überexpression Miltefosin- und Antimon-Resistenz vermittelt. Die Deletion dieses Gens führte zu einer deutlich erhöhten Miltefosin-Sensitivität der Parasiten.