Intrazelluläre Lokalisation des Östrogenrezeptors beta

Abstract

In der vorliegenden Arbeit sollte die intrazelluläre Verteilung des nukleären Östrogenrezeptors beta untersucht werden. Von speziellem Interesse war eine mögliche Assoziation des Proteins mit der Plasmamembran. Als Zellmodell dienten PC-12 Zellen, eine Sekundärzelllinie aus einem Tumor des Nebennierenmarkes der Ratte. Östrogenrezeptoren stellen nach dem bisherigen Verständnis nukleäre Transkriptionsfaktoren dar. In den letzten Jahren sind jedoch Östrogeneffekte beobachtet worden, die aufgrund ihres zeitlichen Verlaufs und der intrazellulären Lokalisation nicht durch eine Modulation der Genexpression zu erklären sind. Es wurden deshalb plasmamembranassoziierte Östrogenrezeptoren postuliert. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Lokalisation der Steroidrezeptoren und Auswirkungen von Östrogen auf die intrazelluläre Verteilung analysiert. Hierzu wurde der humane Östrogenrezeptor beta (hERbeta) N- bzw. C-terminal mit fluoreszierenden Proteinen, dem Enhanced Cyan Fluorescent Protein (ECFP) und dem Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFP), markiert. Die Fusionsgene wurden in PC-12 Zellen transfiziert und die intrazelluläre Verteilung der fluoreszierenden Rezeptoren mittels konventioneller Fluoreszenzmikroskopie und Konfokalmikroskopie betrachtet. Die intrazelluläre Lokalisation von hERbeta war abhängig von der Position der Fluoreszenzmarkierung im Rezeptormolekül. Es zeigte sich eine nukleäre Akkumulation der N-terminal fusionierten Östrogenrezeptoren, wohingegen C-terminal markierte Moleküle überwiegend zytoplasmatisch zu finden waren. Der nukleäre Östrogenrezeptor beta war zu keinem Zeitpunkt an der Plasmamembran lokalisiert. Die Stimulation mit 17beta-Östradiol bewirkte eine Umverteilung von hERbeta im Zellkern, aber keine Umverteilung zwischen verschiedenen Zellkompartimenten. Insbesondere war keine Translokation der Proteine an die Plasmamembran auszumachen. Die Ergebnisse sprechen dafür, dass entweder im gewählten Zellmodell keine Assoziation mit der Plasmamembran stattfindet, oder diese nicht darzustellen ist. Techniken, die spezifisch Zelloberflächenbestandteile nachweisen oder spezifisch Komponenten der Plasmamembran darstellen, sind zur weiteren Untersuchung des Sachverhaltes notwendig.

The aim of this thesis was the analyzation of the intracellular distribution of the nuclear estrogen receptor beta. Of special interest was a possible association of the protein with the plasma membrane. A secondary cell line from a tumor of the adrenal medulla of the rat,PC-12 cells, served as an in vitro model. According to the current understanding, estrogen receptors represent nuclear transcription factors. During the last years estrogen effects have been described, which cannot be explained by modulation of gene expression due to time course and intracellular localization. Thus, plasma membrane-associated estrogen receptors have been postulated.

In this thesis the intracellular localization of the steroid receptor and the effects of estrogen on its intracellular distribution was studied. In order to do this, the human estrogen receptor beta (hERbeta) was tagged to the Enhanced Cyan Fluorescent Protein (ECFP) or the Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFP) N- or C-terminally,, respectively. The constructes were transfected into PC-12 cells and the intracellular distribution of the fluorescent receptors was observed by conventional fluorescence microscopy and confocal microscopy. The intracellular distribution was dependent on the position of the fluorescent tag in the receptor molecule. The receptors, which were labeled on their N-terminus, showed to accumulate in the nucleus, while the C-terminal tagged molecules were predominantly found in the cytoplasm. The nuclear estrogen receptor beta was not located at the plasma membrane at any time. The stimulation with 17beta-estradiol resulted in an intranuclear redistribution, but no redistribution between different cell compartments. Especially, no translocation of the proteins to the plasma membrane could be seen. The results suggest that in the chosen model, either no association with the plasma membrane takes place, or that it cannot be shown. Techniques, which specifically detect structures of the cell surface or specifically label components of the plasma membrane are required to further study the subject.