Die murine T-Zell Ecto-ADP-Ribosyltransferase ART2.2 : Nachweis ihrer Lokalisation in Lipid Rafts und Identifizierung ihrer Zielproteine

Abstract

Bei der ADP-Ribosylierung wird die ADP-Ribose-Gruppe von NAD auf Zielproteine übertragen. Die pathogene Wirkung von Cholera-, Pertussis- und anderen bakteriellen Toxinen beruht auf der ADP-Ribosylierung von Zielproteinen in humanen Wirtszellen. Unsere Arbeitsgruppe hat Toxin-verwandte Mono-ADP-Ribosyltransferasen (ART1- ART5) bei Säugetieren kloniert, die als GPI-verankerte oder sezernierte Ekto-Enzyme exprimiert werden. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der murinen T-Zell ADPRibosyltransferase ART2.2 und der näheren Charakterisierung ihrer Zielproteine. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurden (etheno)-ADP-ribosylierte Membranproteine aus Lymphomzellen affinitätschromatographisch isoliert und mittels Massenspektrometrie identifiziert. Unter den identifizierten Targets befinden sich interessante Zell- Zellinteraktionsmoleküle (CD11/CD18, CD31, CD44, CD205, CD229). Mittels zielgerichteter Mutagenese konnten für den bereits als ART2.2 Target bekannten, Ligandengesteuerten P2X7 Ionen-Kanal zwei Aminosäurereste (Arg 125 und Arg 133) als Ziele der ADP-Ribosylierung eruiert werden. Die Ergebnisse deuten an, dass die an R125 gebundenen ADP-Ribose-Gruppe einen Liganden für die Adenin-Ribonukleotid Bindungstasche des P2X7 präsentiert und dadurch die Öffnung des Ionen-Kanals induziert. Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit wurden ART2.2 überexprimierende transgene Mäuse generiert, und diese in vergleichenden Experimenten mit Wildtyp- und bereits in unserer Arbeitsgruppe etablierten ART2-KO-Mäusen untersucht. Hierbei konnte bestätigt werden, dass die durch ART2.2 katalysierte ADP-Ribosylierung des P2X7 die Apoptose von TZellen auslösen kann. Die Ergebnisse zeigen ferner, dass die Aktivierung von P2X7 zum "Shedding" von enzymatisch aktiver ART2.2 führt. Im dritten Teil wurde die mögliche Assoziation der ART2.2 mit Membran-Mikrodomänen ("Lipid-Rafts") auf der T Zell-Oberfläche untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die ART2.2 dank ihres GPI-Ankers mit Rafts assoziiert ist und durch diese Assoziation in ihrer Aktivität und Spezifität reguliert und auf bestimmte Zielproteine fokussiert wird. Die Ergebnisse dieser Arbeit leisten somit einen Beitrag sowohl zur Aufklärung der Regulation der ART2.2-Aktivität auf der T Zell-Oberfläche als auch zur Klärung des molekularen Mechanismus der P2X7-Aktivierung durch die ADP-Ribosylierung.

ADP-ribosylation is an enzyme-catalyzed posttranslational modificaiton, in which the ADP-ribose moiety is transferred from NAD onto target proteins. The mechanism of action of Cholera-, Pertussis- and other toxins involves the ADP-ribosylation of target proteins in host cells. Mammalian cells express toxin-related mono-ADP-ribosyltransferases (ART1- ART5) as GPI-anchored or secreted ecto-enzymes. The present study focuses on the murine T cell ADP-ribosyltransferase ART2.2 and the characterization of its target proteins. In the first part of the study, (etheno)-ADP-ribosylated membrane proteins were isolated from lymphoma cells and were identified by mass spectrometry. The identified target proteins include several cell-cell-interaction molecules (CD11a/CD18, CD31, CD44, CD205, CD229). The target amino acids for ART2.2 were identified in one of the known target proteins, the ligand-gated P2X7 ion-channel, by site directed mutagenesis (R125 and R133). The results indicate that the ADP-ribose-group bound to R125 presents a ligand for the adenin-ribonucleotide-binding site of the P2X7-channel and thereby gates the ionchannel. In the second part ART2.2 of the study, ART2.2-overexpressing transgenic mice were generated and used for comparative analysis with wildtype and ART2-KO mice. The results confirmed that ART2.2 catalyzed ADP-ribosylation of P2X7 induces apoptosis of T cells. Furthermore the results revealed that activation of P2X7 leads to shedding of enzymatically active ART2.2. In the third part of the study, the association of ART2.2 with so called membranemicrodomains or lipid rafts was investigated. The results show that ART2.2 is associated with lipid rafts due to its GPI-anchor and that this raft-association regulates the activity and specifity of ART2.2. Taken together, the results of this study shed light on the regulation of ART2.2 activity on the T cell surface and clarify the molecular mechanism of P2X7 activation by ADPribosylation.