Genetische Assoziationen von ALOX5-Varianten bei Patienten mit Tuberkulose und Kontrollen in Ghana und funktionelle Bedeutung der strukturellen Veränderung der 5-Lipoxygenase

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Verteilung von zwei ALOX5-Genvarianten in einer Gruppe an Lungentuberkulose erkrankter Patienten (n = 2004) im Vergleich mit derjenigen in einer aus gesunden Individuen bestehenden Kontrollgruppe (n = 2366) in Ghana. Weiterhin sollten durch zellbiologische Verfahren die möglichen Einflüsse der Varianten auf die Funktion der durch ALOX5 kodierten 5-Lipoxygenase (5-LO) bestimmt werden. Im ersten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob die exonische ALOX5-Variante g.760G>A eine unterschiedliche Verteilung bei Fällen und Kontrollen aufwies. Es zeigte sich, dass das „g.760A“-Allel signifikant häufiger in der Gruppe der Tuberkulosefälle vertreten war. Diese unterschiedliche Verteilung von „g.760A“ wurde insbesondere beim Vergleich von mit Mykobakterien der Gruppe Mycobacterium africanum West-African 2 assoziierten Fällen mit Kontrollen deutlich. Des Weiteren wurde die Verteilung des variable number of tandem repeats (VNTR)-Polymorphismus (zwischen den Basenpaarpositionen -147 und -158/-182) im ALOX5-Promotor bestimmt. Bei diesem repeat handelt es sich um eine putative Sp1-Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle, deren Bindungsmotiv hier in zwei bis sechs Kopien vorlag. Keines der fünf Allele wies eine signifikant unterschiedliche Verteilung bei Fällen und Kontrollen auf. Die Genotypen wurden nach einer auf funktionellen Kriterien basierenden Einteilung in den drei Gruppen der „5/5“-Genotypen, „5/nicht-5“-Genotypen und „nicht-5/nicht-5“-Genotypen zusammengefasst. Auf der Grundlage dieser Einteilung zeigte sich bei Fällen ein erhöhtes Vorkommen der „5/nicht-5“-Genotypgruppe gegenüber der „nicht-5/nicht-5“-Genotypgruppe. Haplotypen, die sich aus der exonischen Variante g.760G>A und dem VNTR-Polymorphismus ergaben, wurden ebenfalls auf ihre Verteilung in der Studiengruppe untersucht. Hierbei zeigte sich eine erhöhte Frequenz des „nicht-5/g.760A“-Haplotyps gegenüber dem „nicht-5/g.760G“-Haplotyp in der Fallgruppe. Im zweiten Teil wurden die Auswirkungen des aus der Variante g.760G>A resultierenden Austauschs von Glutaminsäure mit Lysin an der Aminosäureposition 254 (p.Glu254Lys) der 5-LO untersucht. Mögliche Unterschiede zwischen der Wildtyp-5-LO („g.760G“, 254Glu-5-LO) und der mutierten 5-LO („g.760A“, 254Lys-5-LO) wurden nach Expression der beiden 5-LO-Formen in Escherichia coli und HeLa-Zellen durch nachfolgende 5-LO-Aktivitätsassays unter verschiedenen Bedingungen untersucht. In einzelnen Fällen zeigte sich eine Signifikanz oder ein starker Trend für eine leicht erhöhte Aktivität der 254Lys-5-LO. Zusammenfassend sind die Ergebnisse der durchgeführten Experimente starke Indizien für eine entscheidende Rolle der 5-LO in der Abwehr einer Infektion mit Erregern des M. tuberculosis-Komplex.

The object of the present study was to determine the distribution of two ALOX5 variants in a group of patients (n = 2004) with pulmonary tuberculosis and in exposed, apparently healthy controls (n = 2366) in Ghana. In addition, functional experiments where performed to define the influence of the exonic variant on amount and activity of ALOX5-encoded 5-lipoxygenase (5-LO). First, genotype frequencies of the exonic ALOX5 variant g.760G>A were compared between cases and controls. The allele “g.760A” was significantly associated with a higher incidence of tuberculosis. Stratification by mycobacterial lineages revealed that the allelic association was largely due to the occurrence of “g.760A” among cases associated with the lineage Mycobacterium africanum West-African 2. Furthermore, frequencies of polymorphisms of a variable number of tandem repeats (VNTR; located between base pair position -147 to -158/-182 base pairs) of the ALOX5 promoter were analyzed. The repeats are targets for binding of the transcription factor Sp1. Insertions or deletions of the Sp1-binding motif resulted in variant alleles of two to six copies. No significant differences were found when comparing frequencies of alleles between cases and controls. Based on functional criteria, genotypes were combined for further analyses in groups of the genotypes “5/5”, “5/non-5” and “non-5/non-5”. In the combined analysis, the genotype group “5/non-5” occurred significantly more frequently among cases than among controls. When frequencies of estimated haplotypes comprising the exonic alleles “g.760G” and “g.760A” and the grouped VNTR alleles “non-5“ and “5“ were analyzed, the “non-5/g.760A” haplotype was significantly more frequent among cases than the “non-5/g.760G” haplotype. Second, functional implications of the resulting base exchange of glutamic acid and lysin at position 254 (p.Glu254Lys) of 5-LO were determined. Wildtype 5-LO (“g.760G”; 254Glu-5-LO) and mutant 5-LO (“g.760A”; 254Lys-5-LO) were expressed in Escherichia coli and HeLa cells and 5-LO activity was measured under various experimental conditions in both systems. In part, a significance or a strong trend for a higher activity of the 254Lys-5-LO were observed. In summary the observations contribute evidence of the importance of 5-lipoxygenase to the regulation of immune responses to agents of the M. tuberculosis-complex.