Mutp53 Interaktom in einem murinen Tumorzellmodell

Abstract

Missense Mutationen im p53 kodierenden Gen treten nicht nur häufig in humanen Tumoren auf, sondern sind auch in spontan immortalisierten und chemisch transformierten murinen Tumorzellen anzutreffen. Ähnlich wie bei menschlichen Zellen, findet eine Selektion für bestimmte missense Trp53 Mutationen statt, die die Expression von mutantem p53 bedingen. Obwohl mutante p53 Proteine die Fähigkeit verloren haben, pro-apoptotische und Wachstumsarrest auslösende Gene zu transaktivieren, können sie dennoch spezifisch mit Nukleinsäuren und Proteinen interagieren und assoziieren mit Chromatin. Die Expression von mutantem p53 wurde mit Tumor-unterstützenden Effekten in Verbindung gebracht, was als sog. gain-of-function bekannt ist. Um die molekularen Wirkungsmechanismen von mutp53 in einem murinen Tumorzellmodell zu untersuchen, wurde die mutp53 exprimierende MethA Zelllinie verwendet, die aus einem Methylcholanthren induzierten Fibrosarkom einer BALB/c Maus etabliert wurde. Die Technik der RNA induzierten spezifischen Reduktion der Genexpression (RNAi) wurde verwendet, um die mutp53 Expression zu dämpfen und das Verhalten der Zellen unter mutp53 Defizit zu beobachten. Dazu wurden MethA Zellen mit einem Vektor transfiziert, der die Expression einer p53 mRNA spezifischen- oder Kontroll-shRNA ermöglicht. Obwohl der mutp53 Spiegel unmittelbar nach der Transfektion effektiv reduziert werden konnte, war eine Expansion stabiler, mutp53-defizienter Klone nicht möglich. Mittels live cell Imaging Mikroskopie konnte beobachtet werden, dass das Wachstum und Überleben von MethA Zellen bereits durch die Expression einer Kontroll-shRNA dramatisch reduziert wird. Durch die Reduktion von mutp53 wurde dieser Wachstumsarrest sogar noch potenziert. Die mit pSUPshRNA transfizierten MethA Zellen weisen im Vergleich zu untransfizierten Zellen eine stark erhöhte Expression zahlreicher Interferonantwort-assoziierter Gene wie Eif2ak2 (dsRNA abhängige Proteinkinase) und Oas2 (2‘-5‘ Oligonukleotidsynthetase 2) auf, deren Aktivität höchstwahrscheinlich für den beobachteten Wachstumsarrest verantwortlich sind. Die Grundvoraussetzung für eine detaillierte Analyse und Erklärung der Beobachtungen ist die Identifikation funktioneller in vivo Partner von mutp53 und die Charakterisierung dieser Interaktion. Für diesen Zweck wurden Techniken auf Genom-, Transkriptom- sowie Proteomebene verwendet. Durch die ChIP-Seq Methode, die die Identifizierung von mutp53 Bindungsstellen erlaubt, konnte festgestellt werden, dass mutp53 bevorzugt an repetitive DNA Sequenzen bindet, die entfernt von transkriptionellen Startstellen kodierender Gene liegen. Um den Einfluss von mutp53 auf die Transkription zu untersuchen, wurden die Genexpressionprofile der transfizierten Zellen verglichen. Obwohl der Vergleich zwischen den Effekten der Kontroll-shRNA und p53 shRNA wenig aufschlussreich war, da die Nebeneffekte der exogenen dsRNA überwogen, lieferte er einige Hinweise auf einen positiven Einfluss von mutp53 auf den Fortgang der Mitose. Aufgrund vieler Indizien, die für eine funktionelle Verbindung zwischen mutp53 und zellulärer dsRNA sprechen, wurde eine RNA-Immunpräzipitation durchgeführt. Durch Sequenzanalyse der mutp53 assoziierten RNA konnte eine Anreicherung nicht-kodierender, regulatorischer RNAs, nämlich B2-SINE Transkripte und 3' UTR Transkripte identifiziert werden. Dies lieferte erste Hinweise auf eine Beteiligung von mutp53 an der posttranskriptionellen Regulation. Diese Ergebnisse wurden durch die Analyse der mutp53 assoziierten Proteine verstärkt. In mutp53 Multiprotein- Komplexen wurden RNA bindende Proteine der hnRNP Familie, YB1 und Hsc70, die als Ribonukleoprotein-Komplexen in funktionelle Domänen im Nukleus organisiert sind, identifiziert. Zusammenfassend lässt sich erkennen, dass DNA/RNA bindendes mutp53 Protein eine strukturelle Komponente von Transkriptions- und Prozessierungseinheiten ist und durch die Assoziation mit regulatorischen RNAs sowie RNA bindenden Proteinen an der Zelltyp- und Kontextspezifischen Organisation des Chromatins beteiligt sein könnte. Diese Hypothese wird auch durch die Bindung von mutp53 an MAR/SAR Elemente und anderen repetitiven DNA-Elementen unterstützt.

Missense mutations in the gene encoding p53 are not only frequent genetic alterations in human tumor tissue and cell lines, but also in spontaneously immortalized and chemically transformed mouse cells. Similar to human cells, allelic selection for missense Trp53 mutations leads to the expression of mutant p53 (mutp53) proteins. Although mutp53 proteins have lost the transcriptional activity towards pro-apoptotic and growth arrest genes, they can still undergo the specific interactions with nucleic acids and proteins characteristic for wild-type p53 and are targeted to chromatin. The expression of mutp53 has been connected to a gain-of-function by contributing to tumorigenesis. To study the molecular mechanisms of the tumor-promoting and -supporting effect of mutp53 in a mouse tumor cell culture model, we used the mutp53 expressing MethA tumor cell line, which was established from a methylcholanthrene-induced fibrosarcoma in BALB/c mice. As a tool for studying mutp53 activity we used vector-driven expression of shRNA. Although mutp53 down-regulation was efficient immediately after transfection, none of the cells with a reduced mutp53 level could be expanded into stable clones. With the live cell imaging microscopy technique it could be observed that the transfection with dsRNA has a dramatic effect on the growth and survival of MethA cells. The reduction of mutp53 even potentiates the growth arrest. In contrast to untransfected MethA cells the transfection with dsRNA results in a dramatic increase in expression of genes, which are functionally related to the interferon pathway, e.g. PKR and 2'-5' OAS2, which are very likely responsible for the observed arrest and death of MethA cells. The prerequisite for a detailed molecular analysis is the identification of functional in vivo binding partners of mutp53 and the characterization of these interactions. For this purpose we took advantage of three techniques: genome-wide ChIP-Seq, RNA co-IP (RIP), and protein co-IP. Applying the ChIP-Seq Technique we observed that most mutp53 binding sites are rich in repetitive DNA sequences, and are distantly localized from the transcriptional start sites of coding genes. To study the influence of mutp53 on transcription, the gene expression profiles of dsRNA transfected cells were compared. Although this comparison was not very informative due to the dramatic unspecific effects of dsRNA, there are some hints of an involvement of mutp53 in the progression of mitosis. As much evidence points to a functional connection between mutp53 and cellular dsRNA, an RIP was performed subsequently. It was observed that mutp53-bound transcripts are strongly enriched in non-coding regulatory RNA: B2-type SINEs and solitary 3’-UTR transcripts. This observation points to a posttranscriptional regulation by mutp53. This indication is further corroborated by the analysis of mutp53 bound proteins. In mutp53-containg protein complexes a large group of RNA interacting proteins were found by co-IP including members of the hnRNP family, YB1 and Hsc70, which are organized in the nucleus into functional domains and complexes stabilized via RNA. These observations provide a basis for a working model according to which the DNA/RNA binding mutp53 protein is a structural component of transcription/processing factories. Through the association with regulatory RNAs and with RNA binding proteins a function of mutp53 in the cell- and context specific 3D organization of chromatin can be postulated. This hypothesis is supported by the binding of mutp53 to MAR/SAR elements and repetitive DNA-elements.