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dc.contributor.advisorMeier, Chris (Prof. Dr.)
dc.contributor.authorHartjen, Philip
dc.date.accessioned2020-10-19T12:21:36Z-
dc.date.available2020-10-19T12:21:36Z-
dc.date.issued2007
dc.identifier.urihttps://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/2091-
dc.description.abstractDie Störung zellulärer Proteinkinase C (PKC) Aktivität kann in vitro zu Tumorpromotion führen und ist möglicherweise ursächlich an Karzinogeneseprozessen in vivo beteiligt. In vorangegangenen Arbeiten wurde gezeigt, dass Fragmente des Nichtstrukturproteins 3 (NS3) des Hepatitis C Virus (HCV) mit dem katalytischen Zentrum der PKC interagieren, wodurch es zur Inhibition der enzymatischen Aktivität der Kinase kommt (Borowski et al. 1999). Die Inhibition wird von einem auf der Oberfläche von Domäne 2 der NS3 NTPase/Helikase gelegenen, argininreichen Sequenzabschnitt vermittelt, der starke Sequenzhomologie zur autoinhibitorische Pseudosubstratregion der PKC aufweist. Diese Beobachtungen gaben Anlass zur Frage, ob eine NS3-vermittelte PKC-Inhibition an der molekularen Pathogenese der HCV-Infektion, insbesondere an der HCV-assoziierten Hepatokarzinogenese beteiligt ist; ihre Aufklärung war Ziel dieser Arbeit. Es konnte nachgewiesen werden, dass nicht nur NS3-Fragmente, sondern auch die katalytisch aktive NS3 NTPase/Helikase in vitro zu starker PKC-Inhibition führt. Die IC50-Werte für die Inhibition der PKC katalysierten Phosphorylierung von Histon HIIIS durch verschiedene NS3 Konstrukte wurden für alle 11 PKC-Isoformen bestimmt. Sie liegen für die NTPase/Helikase defiziente Mutante und die isolierte Domäne 2 der NS3 NTPase/Helikase, für die meisten Isoformen, im submikromolaren Bereich. Die PKC-Inhibition kommt unabhängig von der enzymatischen NTPase-Aktivität zustande, wie anhand einer NTPase/Helikase defizienten Mutante und durch den Einsatz eines ATP-regenerierenden Systems im PKC-Assay demonstriert werden konnte. Die kinetische Analyse der PKC-NS3-Wechselwirkung ergab, dass die Inhibition im Modus einer mixed type Hemmung erfolgt und hauptsächlich aus der spezifischen Interaktion von Domäne 2 der NS3 NTPase/Helikase mit dem aktiven Zentrum der PKC resultiert. Um die biologische Relevanz dieser Ergebnisse in intakten Zellen zu überprüfen, sowie generelle onkogene Einflüsse von der NS3 NTPase/Helikase zu untersuchen, wurden NIH 3T3 Zellen mit stabiler Expression von NS3-Konstrukten generiert. Zur Bestimmung von Einflüssen der rekombinanten Proteine auf ihre intrazelluläre PKC-Aktivität wurde der Phosphateinbau in das PKC-Substratprotein p80/MARCKS in diesen Zellen nach Stimulation mit dem PKC-Aktivator TPA (12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetat) gemessen. Die NS3-Expression hatte hier keinen signifikanten Einfluss; der gemessene Parameter kann jedoch nur als grober Indikator für die intrazelluläre Gesamtaktivität der meisten PKC-Isoformen angesehen werden, so dass nicht auszuschließen ist, dass die PKC-Inhibition durch NS3 eine Rolle in der Pathogenese der HCV-Infektion spielt. Zur Prüfung möglicher onkogener Effekte durch die NS3 NTPase/Helikase wurden verschiedene zelluläre Eigenschaften transfizierter Zellen untersucht, die im Zusammenhang mit neoplastischer Transformation stehen. Stabil mit der NS3 NTPase/Helikase transfizierte Zellen besitzen keine Koloniebildungsfähigkeit in Soft Agar und auch keine erhöhte DNA-Syntheserate bei Konfluenz. Demzufolge weist die NS3 NTPase/Helikase keine direkt transformierenden Eigenschaften auf. Zur Untersuchung tumorpromovierender Effekte durch die NS3 NTPase/Helikase kamen zwei verschiedene Zellkulturmodelle zum Einsatz. Die Untersuchung transient transfizierter Zellen ergab, dass die NS3 NTPase/Helikase weder in JB6-Cl41-5a-Zellen, noch in c-Src überexprimierenden 3Y1-Rattenfibroblasten eine gesteigerte Koloniebildungsfähigkeit in Soft Agar bewirkt. Die erstgenannte Zelllinie stellt ein gut etabliertes Modell für die Untersuchung von tumorpromoterinduzierter neoplastischer Transformation in vitro dar (Colburn et al. 1980), letztere lässt sich durch Inhibition von PKC-delta zu matrixunabhängiger Proliferation in Soft Agar anregen (Lu et al. 1997). Folglich verursacht die NS3 NTPase/Helikase keine Tumorpromotion und die Ausgangshypothese, nach der sie durch Störung von PKC-Funktionen tumorpromovierend wirkt, wurde nicht bestätigt. Wie in dieser Arbeit erstmalig gezeigt wurde, führt die NS3 NTPase/Helikase jedoch zu Morphologieveränderungen und einer starken Steigerung der Zellproliferation. Diese Einflüsse kommen allerdings unabhängig von einer Inhibition der katalytischen Aktivität von Kinasen der PKC-Familie zustande. Derartige phänotypische Veränderungen werden häufig im Verlauf der Induktion eines Tumorphänotyps beobachtet. Bei der sehr langfristigen, chronischen Einwirkung von NS3 auf Hepatocyten im Verlauf einer chronischen Hepatitis C ist es durchaus wahrscheinlich, dass proliferationsfördernde Faktoren maßgeblich an der Karzinogenese beteiligt sind.de
dc.description.abstractA broad range of biological and biochemical studies document that disturbing protein kinase C (PKC) function induces tumor promotion and may promote carcinogenesis in vivo. In foregoing works it has been demonstrated that fragments of the NTPase/helicase domain of the nonstructural protein 3 (NS3) of hepatitis C virus (HCV) interact with the active site of PKC and reduce catalytic activity of the enzyme (Borowski et al. 1999). The inhibition is mainly mediated by a short arginine rich amino acid stretch localized on the surface of Domain 2 of the NS3-NTPase/helicase. The HCV amino acid sequence of this motif strongly resembles the pseudosubstrate sequence within the autoregulatory domain of PKC. Thus, NS3-mediated PKC-inhibition may be involved in the molecular pathogenesis of the HCV infection, particularly in regard to HCV-associated carcinogenesis leading to hepatocellular carcinoma. The presented thesis sets out to scrutinize this hypothesis. The acquired data clearly demonstrates, that not only fragments of NS3, but catalytically active NS3-NTPase/helicase acts as a potent PKC-inhibitor in vitro. IC50-values for the inhibition of PKC-catalyzed Histone HIIIS phosphorylation by an NTPase/helicase-inactive mutant (NS3h-D1316A) or the isolated domain 2 of the NS3-NTPase/helicase were determined for all 11 PKC-isoforms. They fall within the submicromolar range for the inhibition of most PKC-isoforms. A PKC-activity assay comprising an ATP-regenerating System was applied to confirm these results for wildtype NS3-NTPase/helicase and consequently rule out influences of the D1316A point mutation on the accessibility of the arginine rich stretch. PKC-inhibition by NS3h-D1316A displays a mixed type kinetic pattern and mainly results from a specific interaction between domain 2 and the PKC active site. To elucidate the biological relevance of these findings in intact cells, NIH 3T3 cells with stable expression of the NS3-constructs were generated. These cells were subjected to an assay for intracellular PKC-activity, that employed measuring phosphorylation of the PKC-substrate p80/MARCKS after stimulation with the PKC-activator TPA (12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate). The NS3-expression had no significant effect in this assay. However, the possibility that PKC inhibition plays an important role in HCV pathogenesis can not be ruled out, as the employed method must be regarded as a rough measurement of the overall activity of most PKC isoforms. To scrutinize possible oncogenic effects caused by the NS3-NTPase/helicase, NS3-transfected cells were assayed for several cellular properties that are commonly associated with neoplastic transformation. Stably transfecting NIH 3T3 cells with NS3-constructs did not confer the ability to form colonies in soft agar and did not lead to an elevated DNA-synthesis rate in cells that were grown to confluence. Thus NS3-NTPase/helicase does not exhibit directly transforming properties. To address the question if the NS3-NTPase/helicase exerts tumorpromoting effects, two different cell culture models were utilized. The determination of colony fomation of JB6-Cl41-5a cells is commonly used to assay general tumorpromoting effects in vitro, whereas in c-Src overexpressing 3Y1 cells, anchorage independent growth can specifically be induced by inhibition of PKC-delta activity (Lu et al. 1997). Transient transfection with NS3-constructs did not confer the ability to form colonies in softagar to neither of the two cell lines. These findings strongly suggest that NS3-NTPase/helicase does not cause tumorpromotion. Nonetheless it was shown, that NS3-NTPase/helicase expression in NIH 3T3 cells causes morphological alterations and stongly stimulates cell proliferation, albeit independently from PKC inhibition. To date, this is the first report that attributes the induction of these phenotypic changes to the NTPase/helicase portion of HCV-NS3. Proliferative and morphological changes are often observed in the course of neoplastic transformation. Considering the long term exposure of hepatocytes to NS3 during chronic hepatitis C, it seems eminently reasonable, that proliferation promoting factors substantially contribute to HCV-associated hepatocarcinogenesis.en
dc.language.isodede
dc.publisherStaats- und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky
dc.rightshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2
dc.subjectNS3de
dc.subjectHCVde
dc.subjectEnzyminhibitionde
dc.subjectNS3en
dc.subjectHCVen
dc.subjectenzyme inhibitionen
dc.subject.ddc540 Chemie
dc.titleInhibition von Proteinkinasen der Proteinkinase C Familie durch das Nichtstrukturprotein 3 des Hepatitis C Virusde
dc.title.alternativeInhibition of Protein Kinases of the Protein Kinase C Family by Hepatitis C Virus Nonstructural Protein 3en
dc.typedoctoralThesis
dcterms.dateAccepted2007-12-14
dc.rights.ccNo license
dc.rights.rshttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
dc.subject.bcl35.70 Biochemie: Allgemeines
dc.subject.bcl35.73 Biochemische Reaktionen
dc.subject.bcl42.32 Virologie
dc.subject.gndHepatitis C
dc.subject.gndHepatitis-C-Virus
dc.subject.gndProteinkinase C
dc.subject.gndTumorpromotion
dc.subject.gndCarcinogenese
dc.subject.gndInhibition
dc.type.casraiDissertation-
dc.type.dinidoctoralThesis-
dc.type.driverdoctoralThesis-
dc.type.statusinfo:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.thesisdoctoralThesis
tuhh.opus.id3657
tuhh.opus.datecreation2008-05-05
tuhh.type.opusDissertation-
thesis.grantor.departmentChemie
thesis.grantor.placeHamburg
thesis.grantor.universityOrInstitutionUniversität Hamburg
dcterms.DCMITypeText-
tuhh.gvk.ppn579214524
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:18-36571
item.advisorGNDMeier, Chris (Prof. Dr.)-
item.grantfulltextopen-
item.languageiso639-1other-
item.fulltextWith Fulltext-
item.creatorOrcidHartjen, Philip-
item.creatorGNDHartjen, Philip-
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen
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