NAADP, CD38 und Calcium-Signalling: Komplexes Wechselspiel bei der Aktivierung von T-Lymphozyten

Abstract

1987 machten Clapper und Kollegen durch Experimente an Seeigelei-Mikrosomen die Enteckung, dass Injektionen von Nikotinamidadenindinukleotid-2-phosphat (NADP ) starke Ca2+-Signale auslösen (Clapper et al, 1987). Die Struktur des Botenstoffs, welcher sich als Nikotinsäureadenindinukleotid-2- phosphat (NAADP) herrausstellte, wurde 1995 veröffentlicht (Lee und Aarhus, 1995). NAADP ist bis heute die potenteste Ca2+-freisetzende Substanz. Durch Mikroinjektionsexperimente konnte gezeigt werden, dass NAADP im niedrigen nanomolaren Bereich wirksam ist. Um zu klären welche Funktion NAADP in der Ca2+-vermittelten Signaltransduktion hat und ob es sich vielleicht sogar um einen sekundären Botenstoff handelt, war es erforderlich, die zellulären Konzentration von NAADP zu bestimmen. Dies war erst durch die Etalbierung sensitiver Nachweissysteme möglich. Die Messungen in dieser Arbeit wurden mit einem enzymatischen Cycling-Assay durchgeführt, mit dem die Bestimmung endogener NAADP-Konzentrationen in Suspensionszellen, in adhärent wachsenden Zellen und in Geweben durchführbar ist (Gasser et al, 2006). Durch die Bestimmung von basalen NAADP-Konzentrationen in Jurkat TLymphozyten ergaben sich Konzentrationen von 4nM. Stimulation des T-Zellrezeptor/ CD3-Komplexes führte zu einem biphasischen NAADP-Verlauf. Unmittelbar nach der Stimulation stieg die NAADP-Konzentration um das 7,6 fache an und sank dann auf fast basale Werte wieder ab. Nach fünf Minuten erreichte die NAADP-Konzentration ein zweites Maximum und fiel 50 Minuten nach der Stimulation auf basale Werte zurück. Der schnelle NAADP-Anstieg wird mit der Einleitung der Ca2+-vermittelten Signaltransduktion in Verbindung gebracht (Kinnear et al, 2004; Yamasaki et al, 2005; Gasser et al, 2006 B und Soares et al, 2006). Der biologische Hintergrund der zweiten Erhöhung ist noch unklar. Möglicherweise wird [Ca2+]i in Kombination mit dem auch zu dieser Zeit aktiven Second Messenger zyklische Adenosindiphosphatribose (cADPR) reguliert (Guse et al, 1999). Durch die Blockierung von Tyrosinkinasen mit Genistein konnte die NAADPErhöhung unterdrückt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass es nur zu einem NAADP-Anstieg kam, wenn über den T-Zellrezeptor/CD3-Komplex stimuliert wurde. Eine pharmakologische Entleerung der zellulären Calciumspeicher und eine Aktivierung des Ca2+-permeablen Ionenkanals TRPM2 mit dem Lektin Concanavalin A (Gasser et al, 2006 B) führten zu keiner signifikanten NAADP-Erhöhung. Der NAADP-Anstieg in den Jurkat T-Lymphozyten unterlag einer Konzentrations-Abhängigkeit. Zu den noch offenen Fragen im NAADP-Signalsystem gehören die Synthese und der Abbau des Botenstoffes. In der Literatur wurde häufig postuliert, dass die NAADPBildung über das Ecto-Enzym CD38 verläuft (Liu et al, 2005 und Graeff et al, 2006). Zur Überprüfung der Hypothese wurde in Jurkat T-Lymphozyten die Expression von CD38 vermindert. Der Knock down wurde mit Hilfe von shRNA durchgeführt. Durch eine Zellvereinzelung wurden dann stabile Klone erhalten. Der Erfolg der CD38-Expressionsverminderung wurde durch Western Blot-Analyse und durch die Bestimmung der CD38 vermittelten NAD-Glykohydrolase-Aktivität überprüft. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass die NAADP-Konzentration in den Klonen nicht erniedrigt war. Die CD38 Knock down-Klone wiesen im Vergleich zum Jurkat-WT sogar leicht erhöhte NAADP-Konzentrationen auf. Um eine CD38-Restaktivität als Ursache für die NAADPBildung auszuschließen, wurden Messungen in CD38 Knock out-Mäusen durchgeführt. Es wurden die Milzen und Thymi von WT-Mäusen und den Knock out-Mäusen vermessen. Auch hier zeigte sich, dass die Abwesenheit von CD38 zu erhöhten NAADP-Werten führt. Die Bestimmung der NAADP-Konzentration in HeLa-Zellen, die CD38 überexprimieren, führten im Vergleich zum HeLa-WT zu verminderten NAADP-Konzentrationen. Durch die Experimente konnte somit gezeigt werden, dass CD38 nicht an der Synthese von NAADP beteiligt ist. Die Bestimmung der [Ca2+]i in den CD38 Knock down-Klonen ergaben Verminderungen, die sich stärker in der Plateau-Phase der Ca2+-Signale bemerkbar machten. Es ist bekannt, dass die Bildung der Ca2+-freisetzenden Botensoffe cADPR und Adenosindiphosphatribose (ADPR) über CD38 verläuft (Howard et al, 1993 und Metha et al, 1996). Die Expressionsverminderung von CD38 führt also wahrscheinlich zu einer Erniedrigung dieser Botenstoffe, was sich dann in einer erniedrigten [Ca2+]i äussert. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben zu neuen Erkenntissen in der NAADP vermittelten Signaltransduktion beigetragen. NAADP wird in T-Lymphozyten dem Status eines Ca2+-freisetzenden Botenstoffes gerecht. Hierzu zählen die Kenntnisse um die basalen NAADP-Konzentrationen und der Anstieg nach der Stimulation über den T-Zellrezeptor, sowie die Spezifität und die Konzentrationsabhängigkeit der Stimulation. CD38 konnte als NAADP bildendes Enzym ausgeschlossen werden.

In 1987, Clapper and colleagues discovered that microinjection of Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) into sea urchin microsoms induced Ca2+-transients (Clapper et al, 1987). Because of the high endogenous concentration of NADP it becameclear that an impurity must be responsible for Ca2+-mobilisation. The compound was Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) and is the most potent Ca2+-releasing messenger known today. The structure was published in1995 (Lee and R Aarhus, 1995). Microinjection experiments revealed that NAADP is active in the low nanomolar range. To understand the function of NAADP in Ca2+-signaling cellular NAADP concentrations had to be determined. Measurement of endogenous NAADP was possible after developement of sensitive methods. The results described here were performed with custom-made NAADP Cycling-Assay. This method allows NAADP detection in suspension cells, adherent cells and animal tissues with a detection limit of 50 fmol (Gasser et al, 2006). In unstimulated T cells the NAADP concentration amounted to 4±1nM. Stimulation of the cells via the T cell receptor/CD3 complex, resulted in a biphasic elevation kinetics of cellular NAADP levels. Seconds after stimulation NAADP concentration increased 7,6 fold. The second increase in NAADP had its maximum 5 minutes after stimulation and reached basal levels after 50 minutes of stimulation. The fast increase of NAADP may bi involved in the initiation of Ca2+-signals in the very early phase of the signaling event (Kinnear et al, 2004; Yamasaki et al, 2005; Gasser et al, 2006 B and Soares et al, 2006). The biological meaning of the second elevation is not yet clear. It is possibele that at this time Ca2+-signaling is shaped in coorporation with the established modulator of the ryanodine receptor, cADPR (Guse et al, 1999). A broad band inhibition of Tyr kinases using genistein completely abolished NAADP elevation. An increase in NAADP only occurred after stimulating the cells via the T cell receptor/CD3 complex. An increase in NAADP was neither found upon a pharmacologically induced rise in [Ca2+]i using thapsigargin nor upon stimulation of T lymphocytes via the ADPR/TRPM2 signaling system (Gasser et al, 2006B). A bell-shaped concentration-response curve was found. Metabolism of NAADP is still unclear today. The ectoenzyme CD38 has often been discussed in the literature for being involved in NAADP formation (Liu et al, 2005 und Graeff et al, 2006). To investigate wether CD38 is responsible for NAADP synthesis we performed a CD38 knock down in Jurkat T-lymphocytes, using shRNA induced gene silencing. After generation of stable clones we confirmed the success of the CD38 knock down by western blot-analysis and measurement of glycohydrolase-activity. NAADP measurements revealed that there is no decrease in NAADP concentration in the knock down clones. In fact, NAADP levels in CD38 knock down clones seemed to be slightly elevated compared to Jurkat-WT. To exclude the possibility that NAADP formation occurred because of the remaining CD38 molecules in the CD38 Knock down clones, we also performed NAADP measurements in CD38-/-mice. NAADP measurements were performed in thymus and spleen of WT-mice and CD38-/-mice and revealed that NAADP levels in CD38-/--tissues were elevated. NAADP levels in CD38pos-HeLa were strongly reduced compared to HeLa-WT. All experiments suggest that CD38 is not involved in NAADP synthesis. The increase in NAADP in the CD38 knock down clones and CD38 -/--tissues may be a consequence of the decrease of cADPR. Ca2+-measurements showed reduced [Ca2+]i in CD38 knock down clones as compared to Jurkat-WT. The reduction was more pronounced in the plateau phase of the Ca2+- signal. The experiments, using OKT3 for stimulation, indicated that Cyclic adenosine diphosphate-ribose (cADPR) and Adenosine diphosphate-ribose (ADPR) is reduced. Stimulation with the lectin Concanavalin A pointed out that ADPR is decreased. Both Ca2+-measurements support the hypothesis that NAADP is increased to compensate for a reduction in cADPR concentration. All together, the results of the current PhD thesis provide new insights into NAADP mediated Ca2+-signaling. According to Lee (Lee, 2003) and Rutter (Rutter, 2003) most of the criteria for the establishment for NAADP as second messenger are now fulfilled. Basal NAADP concentrations were determined. Stimulation resulted in a biphasic elevation in NAADP concentration. Increase in NAADP specifically occurred after stimulation via the T cellreceptor/CD3-complex. Gene silencing and KO-mice suggest that CD38 is not involved in NAADP formation. The fact that NAADP is the initial Ca2+-releasing messenger after stimulation of the cells makes this compound a valuable target for pharmacological research.