Isolation und Charakterisierung einer minimalen funktionellen Domäne mit ATP-bindenden Eigenschaften der NTPase/Helikase des Hepatitis C Viruses

Abstract

Die RNA-stimulierte Nukleosidtriphosphatase und Helikase des Hepatitis C Viruses (HCV) besteht aus drei Domänen. In der ersten Domäne finden sich hoch konservierte Motive ATP-bindender Stellen. Die in dieser Arbeit vorgestellte ATP-bindende Domäne wurde durch die limitierte Proteolyse eines größeren Fragmentes des HCV-Polyproteins gewonnen und chromatographisch gereinigt. Die Identität der Domäne, die aus den Aminosäuren 1203-1364 des HCV-Polyproteins besteht, wurde durch C- und N-terminale Sequenzierung und die Fähigkeit 5´-Fluorosulfonylbenzoyl-adenosine (FSBA) zu binden bestätigt.

Die kinetische Analyse der ATP-Bindung ergibt eine "single class"-Bindungsstelle mit einer Kd von 43,6 µM. Die Bindung ist zu sättigen und ist abhängig von dem Vorliegen von Mn- oder Mg-Ionen in der Reaktionslösung. Poly[A] und Poly[dA] zeigen eine interessante Eigenschaft als Regulatoren der ATP-Bindungskapazität der Domäne. Die Polynukleotide binden an die Domäne und erhöhen deren Affinität zu ATP. Andererseits erhöht ATP auch die Affinität der Domäne zu den Polynukleotiden.

Verschiedene Compounds, die für ihre Fähigkeit bekannt sind, mit nukleotidbindenden Stellen von Enzymen verschiedener Klassen zu interagieren, wurden auf ihr Potential, die ATP-Bindung zu inhibieren, untersucht. Es wurden zwei Reagenzien mit inhibitorischer Wirkung gefunden und die Mechanismen der Hemmung der ATP-Bindung durch kinetische Analysen ermittelt: Paclitaxel, das die ATP-Bindung kompetetiv hemmt (IC50 = 22 µM), und Trifluoperazine, das die ATP-Bindung durch einen nicht-kompetetiven Mechanismus hemmt (IC50 = 98 µM). Kinetische Untersuchungen der Inhibition der NTPase/Helikase durch Paclitaxel und Trifluoperazin weisen darauf hin, dass beide Compounds die NTPase-Aktivität des Holoenzyms durch die Interaktion mit der ATP-bindenden Domäne hemmen, weil die Inhibition von der Konzentration der Inhibitoren abhängig war und sich die IC50-Werte für die Hemmung der ATP-Bindung und der Hemmung der NTPase-Aktivität weitestgehend entsprachen.

Aufgrund der hier dargestellten Daten halte ich die Inhibition der ATP-Bindung an die ATP-bindende Domäne für eine attraktive Strategie zur Entwicklung potenter Inhibitoren des Enzyms.

The RNA-stimulated nucleoside triphosphatase (NTPase) and helicase of hepatitis C virus (HCV) consists of three domains with highly conserved NTP binding motifs located in the first domain. The ATP-binding domain was obtained by limited proteolysis of a greater fragment of the HCV polyprotein, and it was purified to homogenity by column chromatography. The identity of the domain, comprising amino acids 1203 to 1364 of the HCV polyprotein, was confirmed by N- and C-terminal sequencing and by its capability to bind 50-fluorosulfonylbenzoyladenosine (FSBA).

The analyses of the kinetics of ATP binding revealed a single class of binding site with the Kd of 43.6 mm. The binding is saturable and dependent on Mn2+ or Mg2+ ions. Poly(A) and poly(dA) show interesting properties as regulators of the ATP-binding capacity of the domain. Polynucleotides bind to the domain and enhance its affinity for ATP. In addition, ATP enhances the affinity of the domain for the polynucleotides.

Different compounds, which are known to interact with nucleotide binding sites of various classes of enzymes, were tested for their ability to inhibit the binding of ATP to the domain. Of the compounds tested, two agents behaved as inhibitors: paclitaxel, which inhibits the ATP binding competitively (IC50 = 22 mm), and trifluoperazine, which inhibits the ATP binding by a noncompetitive mechanism (IC50 = 98 mm). Kinetic experiments with the NTPase/helicase indicate that both compounds inhibit the NTPase activity of the holoenzyme by interacting with its ATP-binding domain.