Enzymkinetik der humanen RNase Dicer in Zellextrakten und Charakterisierung eines Sulforhodamin B bindenden RNA-Aptamers mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie

Abstract

Das RNase III-Enzym Dicer ist beteiligt an der posttranskriptionellen und translationalen Regulation der Genexpression. Das Enzym weist in gereinigter Form eine sehr geringe Aktivität auf. In der vorliegenden Arbeit wurde humaner Dicer deshalb in Gegenwart zytosolischer Komponenten, in zytosolischen Zellextrakten, enzymkinetisch charakterisiert. Ein auf Diffusion basierter Enzym-Assay wurde mittels Fluoreszenz-Korrelations- Spektroskopie (FCS) entwickelt. Der Enzym-Substrat-Komplex (ES-Komplex) konnte von Substrat und Produkt durch seine signifikant höhere Diffusionszeit unterschieden werden. Die Substratabhängigkeit der Dicer-Aktivität in zytosolischen HEK293-Zellextrakten ergab eine halbmaximale Enzymaktivität bei einer Substratkonzentration von 76 nM. Mit Hilfe der ES-Komplex-Konzentration wurde für überproduzierten humanen Dicer eine katalytische Konstante von 42 s-1 und eine Spezifitätskonstante von 5,5 x 108 M-1 s-1 im diffusionslimitierten Bereich bestimmt. Es wurde mit einem Hill-Koeffizienten von 1,8 eine positive Kooperativität festgestellt, die einen Hinweis auf die Regulation der Aktivität gibt. Die Anwendung von state-of-the-art konfokaler Mikroskopie und neu entwickelten photostabileren Fluorophoren, das Fixieren von Diffusionszeiten in der Fitting-Routine und die Verwendung von Grenzwerten in der Datenanalyse erlaubten eine Unterscheidung zwischen Diffusionsspezies über Konzentrationsunterschiede von vier Größenordnungen. In einem zweiten Projekt wurde das Sulforhodamin B bindende RNA-Aptamer mittels FCS analysiert. Es wurde demonstriert, dass in FCS-Messungen von Aptamer- Fluorophor-Komplexen simultan photophysikalische Eigenschaften des Fluorophors und Mobilität sowie molekulare Größe der RNA erfasst werden können. Sulforhodamin B wies im SRB2m-Komplex eine 4-fach erhöhte Diffusionszeit auf. Das Fluorophor Patent Blau V (PBV) ergab keine Autokorrelationsfunktion. Die erheblich erhöhte molekulare Zählrate im Komplex mit SRB2m ermöglichte FCS-Messungen. Der hydrodynamische Radius rH von SRB2m betrug im Komplex mit PBV 1,9 nm und mit Sulforhodamin B 2,9 nm. Die Hypothese einer durch PBV verursachten Reduktion der molekularen Größe der RNA, die verbunden ist mit einer Auftrennung in Monomere, wurde in Experimenten mit Roentgenkleinwinkelstreuung bestätigt.

The RNase III-enzyme Dicer is involved in the posttranscriptional and translational regulation of gene expression.The human RNase Dicer shows, when purified, very low activity. Therefore, in this work, human Dicer was enzymatically characterized in cytosolic cell extracts in the presence of cytosolic cofactors. An enzyme assay based on changes of diffusion time was developed with fluorescence correlation spectroscopy (FCS). The enzyme substrate (ES)-complex did show a significantly higher diffusion time than product and substrate, and could therefore be distinguished from the two diffusion species. The dependence of enzyme activity on substrate concentration of human Dicer was further investigated in cytosolic HEK293-cell extracts. The enzyme attained the half maximum enzyme activity at a substrate concentration of 76 nM. The pico- to femtomolar ES-complex concentration increased after Dicer overexpression and showed a similar dependence on substrate concentration as did enzyme activity. ES-complex concentration remained relatively constant during linear product formation. The analysis of the ES-complex with respect to enzyme kinetic theory reveals the accuracy of the experimental data. Using ES-complex concentrations, a catalytic constant of 42 s-1 and a specificity constant of 5.5 x 108 M-1 s-1 close to the diffusion limited range were found for overproduced human Dicer. A positive cooperativity with a hill coefficient of 1.8 was deduced, giving a first look into the mode of regulation of enzyme activity. Endogenous Dicer gave kinetic constants of similar range. Applying state-of-the-art confocal microscopy and newly developed more photostable fluorophores, setting known diffusion times as fixed values in the fitting procedure and applying thresholds in data analysis allowed a discrimination between diffusion species over concentration differences of four orders of magnitude. In a second project, the sulforhodamine B binding RNA aptamer SRB2m was analyzed by FCS. In this work it was demonstrated, that photophysical properties of the fluorophore as well as mobility and molecular size of the RNA in fluorophor-aptamer-complexes could be simultaneously measured by FCS. The sulforhodamine B-SRB2m complex showed a 4-fold increased diffusion time compared to unbound sulforhodamine B. A second fluorophore, patent blue V (PBV), gave no autocorrelation function. The 36-fold increased molecular brightness of the complex of PBV and SRB2m enabled FCS measurements with excellent signal-to-noise-ratio. The hydrodynamic radius rH of the PBV- and Sulforhodamin B-SRB2m complex was 1.9 nm and 2.9 nm, respectively. The hypothesis that a reduction of the molecular size of SRB2m by PBV due to a separation into monomers occurred, was verified by small angle X-ray scattering experiments.