Untersuchung von Hypochlorit-modifizierten Proteinen und deren Rolle bei der Inhibition von HIV

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig HOCl-modifiziertes HSA, BSA und MSA (mHSA, mBSA und mMSA) im technischen Maßstab mithilfe des Hohlfasersystems hergestellt. Mit diesem System kann bei einer potentiell therapeutischen Anwendung der Inhibitor in noch größeren Mengen produziert werden. Die relativen IC50-Werte der so hergestellten HOCl-modifizierten Serumalbumine wurden mithilfe eines HIVNL4-3wt-Infektionstest und dem Programm GraphPad Prism (Fa. GraphPad Software) bestimmt (mHSA 1:1000 > 5 μg/ml, mBSA 1:1000 > 3 μg/ml und mMSA 1:1000 > 20 μg/ml). Dass die antivirale Aktivität dieser Proteine nicht durch einen zelltoxischen Effekt verursacht wird, wurde durch einen Zellvitalitätstest gezeigt. Die Vitalität von HeLaP4-Zellen blieb bis zu einer Konzentration von 400 μg/ml mHSA und mBSA 1:1000 bzw. > 200 μg/ml mMSA 1:1000 erhalten. Zusätzlich wurde eine alternative Lagerung des Inhibitors etabliert, bei welcher die Proteine getrocknet wurden. Für Surface Plasmon Resonance-(SPR)-Bindungsstudien, die zeigten, dass der Inhibitor an das HIV-Oberflächenprotein gp120 bindet, wurde mHSA 1:1000 erstmalig biotinyliert. Der biotinylierte Inhibitor wurde im Gegensatz zur vorherigen Methode direkt auf einem Biosensor immobilisiert, wodurch es zu einer einer stabileren Messung und zu einem verbesserten Wert der Bindungskonstante (KD >10-9 M) kam. Zusätzlich wurde mit den Daten dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt, dass die antivirale Aktivität des Inhibitors mit einer Veränderung der Aminosäurereste einhergeht. Es wurden kolorimetrische Tests durchgeführt, durch die eine HOClinduzierte Abnahme des Aminogruppen (NH2)- und Thiolgruppengehalts (-SH), sowie eine Zunahme des Carbonylgruppengehalts (-CO) in Proteinen gemessen wurde. Eine Abnahme des NH2-Gehalts führt zu einer Abnahme der positiven Gesamtladung. Durch die HOCl-Oxidation von -CO und -SH wiederum können negativ geladene Carboxylund Sulfonylgruppen entstehen. Eine Aminosäurenanalyse in Zusammenarbeit mit dem Forschungszentrum Borstel von mHSA, mBSA und mMSA 1:1 bis 1:1000 zeigte außerdem, dass der Anteil der Aminosäuren in der Reihenfolge Cys > Tyr > His > Met > Phe > Arg durch HOCl modifiziert wird. Durch die Modifizierung von Poly(Glu,Lys,Tyr) wurde weiterhin die Rolle des Tyrosins bei der Bildung des antiviralen Effekts deutlich, da der Tyrosinrest im Poly(Glu,Lys,Tyr) der einzige reaktive Aminosäurerest ist.