Entwicklung und Validierung eines Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase (DDAH)-Aktivitätsassays in Gewebehomogenat

Abstract

NG-NG-Dimethyl-L-Arginin (ADMA) ist ein endogen vorkommender Hemmstoff der Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS). ADMA entsteht bei Abbau von Proteinen, die posttranslational methylierte Argininreste enthalten. Bei verschiedenen Erkrankungen wurde eine erhöhte ADMA-Konzentration im Plasma gefunden, die wiederum mit einer ungünstigen klinischen Prognose assoziiert sind. ADMA wird durch das Enzym Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase (DDAH) abgebaut. Erste Untersuchungen an DDAH- überexprimierenden bzw. -defizienten Mäusen weisen auf einen kausalen Zusammenhang zwischen Störungen der DDAH-Aktivität und kardiovaskulären Erkrankungen hin. Die DDAH könnte somit ein potentielles Ziel für therapeutische Interventionen bei einer erhöhten ADMA-Konzentration darstellen. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb ein DDAH-Aktivitätsassay für Gewebehomogenat von Mäusen etabliert. Voraussetzung dafür war eine zuverlässige analytische Methode zur Bestimmung von L-Arginin und dessen Analoga. Bisherige analytische Methoden erfüllen nicht die geforderten Kriterien von Selektivität und Genauigkeit bzw. erreichen diese nur nach zeit- und materialaufwendiger Probenvorbereitung. Eine neue LC-MS/MS-Methode für die zuverlässige Bestimmung von ADMA, Arginin, NG-NG´-Dimethyl-L-Arginin (SDMA) wurde entwickelt und validiert. In einem weiteren Schritt wurde die neue LC-MS/MS-Methode für den Einsatz im 96-Well System optimiert. Der DDAH-Aktivitätsassay basiert auf dem Einsatz mit stabilem Isotopenmarkiertem ADMA. NG, NG-[2H6]-Dimethyl-L-Arginin ([2H6]-ADMA) und NG, NG-[5C132H6]-Dimethyl-L-Arginin ([5C132H6]-ADMA) waren kommerziell nicht verfügbar und wurden selbst synthetisiert. Durch Einsatz von [5C132H6]-ADMA als internem Standard und [2H6]-ADMA als Substrat konnte nicht nur die DDAH-Aktivität in Gewebehomogenat, sondern auch die Veränderung (Bildung und Abbau) des endogenen ADMA verfolgt werden. In Modifikationen wurde mittels dieses Assays auch die DDAH-Aktivität im Vollblut bestimmt, was den Weg zu einer breiteren klinischen Anwendung ebnet.

NG-NG-dimethyl-L-arginine (ADMA) is an endogenous inhibitor of nitric oxide synthase (NOS). ADMA is released by protein hydrolysis, which contains posttranslational methylated arginine residues. An elevated ADMA concentration has been associated with several diseases and with an unfavourable clinical prognosis in these conditions. ADMA is metabolized by the enzyme dimethylarginine-dimethylaminohydrolase (DDAH). Early investigations in DDAH- overexpressing or -deficient mice pointed to a causal association between disturbances of DDAH activity and cardiovascular diseases. Therefore DDAH activity could represent a potential target for therapeutic intervention in conditions where the ADMA concentration is elevated. In the present work a DDAH activity assay in tissue homogenate of mice was established. Prerequisite was a reliable analytical method for arginine and its analogues. The available analytical methods did not fulfil the criteria of selectivity and accuracy or do so only after extensive time and material consuming sample preparation. A new LC-MS/MS-method for reliable measurement of ADMA, arginine and SDMA was developed and validated. In a further step the new LC-MS/MS method was adapted to the 96-well system. The DDAH activity assay is based on the metabolism of stable-isotope-labelled ADMA. NG, NG-[2H6]-dimethyl-L-arginine ([2H6]-ADMA) and NG, NG-[5C132H6]-dimethyl-L-arginine ([5C132H6]-ADMA) were not commercially available and had to be synthesised. Using deuterium labelled ADMA ([2H6]-ADMA) as substrate and the double stable-isotope-labelled ADMA ([5C132H6]-ADMA) as internal standard allowed the determination not only of the DDAH activity in tissue homogenate, but also that of the metabolism of endogenous ADMA. Modifying this assay allowed the assessment of the DDAH activity in whole blood, which enables its use in a clinical setting