| Zusammenfassung: | Intramembrane Serinproteasen gehören zur Familie der Rhomboide, die in allen Organismenreichen vertreten sind. Charakteristisch für die Rhomboidproteasen sind sechs bis sieben Membranspannende Domänen und ein katalytisches Zentrum. Dieses besteht aus einem Serin und einem Histidin, die beide innerhalb verschiedener Membrandomänen lokalisiert sind und entsprechend ihre Substrate innerhalb der Membr... Intramembrane Serinproteasen gehören zur Familie der Rhomboide, die in allen Organismenreichen vertreten sind. Charakteristisch für die Rhomboidproteasen sind sechs bis sieben Membranspannende Domänen und ein katalytisches Zentrum. Dieses besteht aus einem Serin und einem Histidin, die beide innerhalb verschiedener Membrandomänen lokalisiert sind und entsprechend ihre Substrate innerhalb der Membran spalten.
Über die mitochondriale Rhomboidprotease Pcp1 aus der Hefe ist bislang sehr wenig bekannt. Meist wird sie nur in Zusammenhang mit ihren Substraten, die Cytochrom c Peroxidase und Mgm1, beschrieben. Daher konzentriert sich diese Arbeit auf die Charakterisierung dieser Protease. Die Genregulierung, Prozessierung und Organisation in der Membran werden untersucht.
Die kernkodierte Rhomboidprotease Pcp1 der Hefe wird in die Mitochondrien importiert und ist dort als Signalpeptidase am Abbau von reaktivem Sauerstoff, sowie an der Fusion von Mitochondrien beteiligt. Das Vorläuferprotein Pcp1p wird im Cytosol mit einer N-terminalen Signalsequenz synthetisiert, die während des Imports in die Mitochondrien abgespalten wird.
Zur Identifizierung der an der Prozessierung der Rhomboidprotease Pcp1p beteiligten Signalpeptidase(n) wurden in dieser Arbeit 60 Mutanten analysiert, in denen die Gene für potentielle mitochondriale Proteasen bzw. Proteine, die mit Proteasen interagieren, deletiert oder inaktiviert waren. Keine der bekannten Signalpeptidasen ist an dieser proteolytischen Spaltung beteiligt, ebenso wenig wie alle weiteren bekannten mitochondrialen Proteasen. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Prozessierung nicht autokatalytisch erfolgt, obwohl Pcp1p selbst als Signalpeptidase aktiv ist. Pcp1p besitzt eine katalytische Dyade, die aus dem Serin an Position 256 und dem Histidin an Position 313 besteht. Punktmutationen in diesen Aminosäuren führen zu einem vollständigen Verlust der Protease-Aktivität, verhindern aber nicht ihre Integration in die innere mitochondriale Membran.
Untersuchungen zur Genregulierung von PCP1 haben gezeigt, dass während der logarithmischen Wachstumsphase am meisten PCP1-mRNA nachgewiesen werden kann, die Menge des reifen Proteins ist allerdings während der stationären Wachstumsphase am Größten. Darüber hinaus ließ sich kein Hinweis darauf finden, dass die Proteaseaktivität von Pcp1p durch eine Phosphorylierung reguliert wird.
Die Untersuchung solubilisierter mitochondrialer Membranproteine mittels der Blue Native-PAGE (BN-PAGE) ergab, dass Pcp1p in einem Komplex organisiert ist. Die Größe des Komplexes ließ sich durch den Nachweis von Pcp1p nicht eindeutig bestimmen, da die detektierte Bande von einer Komplexgröße von 130 kDa bis über 1000 kDa reichte.
Die Deletion einzelner oder benachbarter Transmembrandomänen aus Pcp1p führte zu einem Aktivitätsverlust der Protease, die trotzdem in die Membran und auch in den Komplex integriert wurde. Die Deletionen hatten keinen sichtbaren Einfluss auf die Komplexgröße.
Aus der Literatur war bekannt, dass das Gen für die mitochondriale Rhomboidprotease des Menschen nach Expression in der Hefe die Funktion des Hefegens übernehmen kann. Im Gegensatz dazu wurde in E. coli exprimiertes Pcp1p trotz der Homologien zu dem bakteriellen Rhomboid GlpG nicht von der E. coli-Zelle erkannt und in die periplasmatische Membran integriert. |
