Charakterisierung der putativen SERA-Cysteinproteasen-Familie während der Leberphase von Plasmodium berghei (Vincke und Lips, 1948).

Abstract

Malaria wird durch einen intrazellulären Parasiten der Klasse Apikomplexa verursacht. Der Plasmodium Lebenszyklus besteht aus einer abwechselnden Folge von invasiven und replikativen Entwicklungsstadien innerhalb des Wirbeltier-Wirts und dem Hauptüberträger, der weiblichen Anopheles-Mücke. Großes Interesse galt bisher der Aufklärung des Plasmodium Invasionsprozesses. Weniger detailiert untersucht ist jedoch, wie Plasmodien ihre Wirtszelle nach erfolgreich abgeschlossener Replikation verlassen. Zum Ende der exo-erythrozytären Phase lösen sich Plasmodium-infizierte Hepatozyten von benachbarten Hepatozyten ab und merozoitengefüllte Vesikel - Merosomen genannt -, schnüren sich von infizierten Hepatozyten in das Lumen von Lebersinusoiden ab. Dabei werden die Merozoiten aus der PVM anhand eines Cysteinproteasen-abhängigen Prozesses freigesetzt und verteilen sich im Wirtszellzytoplasma. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die putativen „Serin Repeat Antigen“ (SERA) Cysteinproteasen in Hinblick auf die Beteiligung an der Merozoitenfreisetzung aus der Hepatoma-Wirtszelle untersucht. Anhand von RT-PCR und Promotoranalysen wurde ein Transkriptionsprofil der P. berghei SERAs (PbSERAs) während des gesamten Lebenszyklus erstellt. Die Transkription der putativen Proteasen wird stadienspezifisch reguliert und PbSERA1-4 mRNA wird während der späten Leberphase des Parasiten stark hochreguliert. Zudem wurde die Synthese, Prozessierung und Lokalisierung der PbSERAs umfassend charakterisiert. Dafür wurden verschiedene Antiseren und monoklonale Antikörper gegen unterschiedliche Regionen von PbSERA1, PbSERA2, PbSERA3 und PbSERA4 hergestellt. Zusätzlich wurden transgene Parasiten generiert, die PbSERA3 mit einem C-terminalen TAP-Tag exprimieren. Western Blot Analysen zeigten, dass die PbSERA Pro-Peptide in der späten Leber- und Blutphase des Parasiten mehrfach prozessiert werden, resultierend in einer ca. 55 kDa Papain-ähnlichen Proteasendomäne. Einige Plasmodium SERA Proteine („Serin-Typ“ SERAs) besitzen ein katalytisches Serin im aktiven Zentrum der Proteasendomäne anstelle eines für „Cystein-Typ“ SERAs charakteristischen Cysteins. Interessanterweise unterscheidet sich die Lokalisierung der beiden Serin-Typ SERAs (PbSERA1 und PbSERA2) innerhalb der infizierten Hepatomazelle stark von den Cystein-Typ SERAs (PbSERA3 und PbSERA4). PbSERA1 findet sich in den multiplen Zellkernen des Parasiten, PbSERA2 in naher Assoziation zur parasitophoren Vakuolenmembran (PVM) und PbSERA3 und PbSERA4 vorrangig im Parasiten-Zytoplasma, sowie zum Ende der exo-erythrozytären Entwicklung des Parasiten zunehmend in derparasitophoren Vakuole. Mehrfache Versuche PbSERA3 genetisch auszuschalten, blieben ohne Erfolg und lassen daher eine essentielle Funktion von PbSERA3 vermuten. SERA Proteasen werden in P. falciparum Blutstadien bekanntlich von der Serinprotease Subtilisin1 (PfSUB1) prozessiert, die innerhalb einer Prozessierungskaskade wiederum von der Cysteinprotease Dipeptidyl Peptidase 3 (PfDPAP3) aktiviert wird. Für die Charakterisierung der P.berghei Homologen PbDPAP3 und PbSUB1 wurden Antiseren hergestellt und für Western Blot- und Immunfluoreszenzanalysen eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass beide Proteasen während der Leberphase exprimiert und auch aktiviert werden. Damit kann davon ausgegangen werden, dass es auch während der Leberphase zur Aktivierung der Proteasenkaskade PbDPAP3 - PbSUB1- PbSERA1-4 kommt.