Functional Investigation of the ATPase/Helicase Domain of Human Dicer

Abstract

The aim of this study was the recombinantly production, and characterisation of the ATPase/Helicase (A/Hel) domain of human Dicer (hDicer). The production of the A/Hel domain of hDicer as a His-tag-fusion protein in E. coli resulted in the formation of insoluble protein aggregates (inclusion bodies). However, the N-terminal fusion of maltose-binding protein (MBP) from E. coli to the A/Hel domain resulted in the production of a soluble A/Hel protein, which was purified to homogeneity using amylose and Ni-NTA affinity chromatographies. The A/Hel domain was also produced in High Five insect cells but the resultant protein could not be purified to homogeneity. The A/Hel protein exhibited an ATPase activity independent of the presence of RNA but dependent on Mg2+ ions. The ATPase reaction followed Michaelis-Menten kinetics with a corresponding Km ATP constant of 207.5 DM and a turnover number, kcat ATP, of 10 min-1. The recombinant protein showed nucleotide specificity, hydrolyzing only purine and not pyrimidine triphosphates. Additionally, the protein did bind single-stranded RNA (ssRNA), but did not bind small interfering RNA (siRNA). Furthermore, gel-shift and Florescence Resonance Energy Transfer (FRET)-based assays used to investigate unwinding activity showed that the A/Hel protein was unable to unwind dsRNA substrates used in this study. Moreover, using the FRET-based assay, it could be demonstrated that the protein enhanced RNA annealing. Future experiments should be based on the elucidation of the physiological significance of these results. Together with the outcome of the physiological investigations, the results of this study could provide an insight into the functions of hDicer and contribute to our understanding of its mode of action within RNA interference.

Ziel dieser Arbeit war die rekombinante Produktion und Charakterisierung der ATPase/Helicase (A/Hel)-Domäne vom humanen Dicer (hDicer). Die Produktion der A/Hel- Domäne des hDicer als His-Tag-Fusionsprotein in E. coli ergab unlösliche Proteinaggregate (Inclusion Bodies). Die N-terminale Fusion des Maltose-Bindungsprotein (MBP) von E. coli mit der A/Hel- Domäne ergab die Produktion eines löslichen A/Hel-Proteins, welches mittels Affinitätschromatographie über Amylose und Ni-NTA Säulen aufgereinigt werden konnte. Zusätzlich wurde die A/Hel-Domäne in High-Five-Insekten-Zellen produziert. Das resultierende Protein konnte jedoch nicht mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt werden. Das A/Hel-Protein besaß eine ATPase-Aktivität, die unabhängig von der Anwesenheit von RNA, jedoch abhängig von Mg2+ Ionen war. Die ATPase-Reaktion folgte der Michaelis- Menten-Kinetik mit einer korrespondierenden Km ATP-Konstante von 207,5 DM und einer Wechselzahl kcat ATP von 10 min-1. Das rekombinante Protein zeigte Nukleotidspezifität, da es nur Purin-, nicht jedoch Pyrimidin-Triphosphate hydrolysierte. Zusätzlich band das Protein an einzelsträngige RNA (ssRNA), aber nicht an Small Interfering RNA (siRNA). Des Weiteren wurden zur Untersuchung der Entwindungsaktivität Gel-Shift- und Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer (FRET)-basierende Assays durchgeführt. Es zeigte sich, dass das A/Hel-Protein nicht dazu fähig war, die als Substrat dienende dsRNA zu entwinden. Es wurde jedoch mit Hilfe des FRET-Assays nachgewiesen, dass das Protein das Annealing an RNA verstärkt. Auf diesen Ergebnissen sollten zukünftige Experimente für die Aufklärung der physiologischen Signifikanz basieren. Die Ergebnisse auf dieser Arbeit aufbauender physiologischer Untersuchungen können die Erkentnisse dieser Arbeit ergänzen und so zum 6 Zusammenfassung 86 Verständnis über die Funktion des hDicer-Proteins und seiner Rolle im Mechanismus der RNA-Interferenz beitragen.