Einfluss von Topoisomerase II Inhibitoren auf die Reparatur von Doppelstrangbrüchen durch Homologe Rekombination und Nichthomologes Endjoining

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Inhibition der Topoisomerase II durch Etoposid die Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSB), die nach Bestrahlung die entscheidenden letalen DNA-Schäden darstellen, beeinflusst. Eine Hemmung der Reparatur der DSB kann als Ursache für eine Strahlensensibilisierung der Zelle gesehen werden. Die möglichen Reparaturwege sind das NHEJ und die HR: Die HR nutzt als konservativer Reparaturweg eine zum DSB homologe Sequenz für eine fehlerfreie Reparatur. Das NHEJ ligiert ohne eine Matrize die vorher bereinigten Bruchenden der DSB. Um beide Reparaturwege getrennt voneinander – aber vergleichbar – untersuchen zu können, wurden bereits zuvor entwickelte Konstrukte genutzt. Diese tragen das Gen für das „Grünfluoreszenz Protein“. Durch Transfektion eines Plasmids, welches die I-SceI-Endonuklease kodiert, wurden an spezifischen Erkennungssequenzen im Konstrukt DSB induziert. Die Zelle repariert die DSB, je nach Konstrukt, und zeigt eine erfolgreiche Reparatur mit einer Grünfluoreszenz an. Es wurde in der vorliegenden Arbeit auch der Zeitverlauf der einzelnen Reparaturwege untersucht. Reparaturereignisse durch Nichthomologes Endjoining konnten bereits 4 Stunden vor den Reparaturereignissen durch Homologe Rekombination gemessen werden. In einem weiteren Schritt wurde die Wirkung des Topo-II-Inhibitors Etoposid auf die beiden o.g. Reparaturwege untersucht. Die Topo-II ist ein Enzym, welches den topologischen Zustand der DNA verändern kann. Sie kathalysiert den ATP-abhängigen Transport von einer intakten Doppelhelix durch eine zweite, bei der zuvor ein DSB verursacht wurde. Somit wird eine Entwindung der DNA bei wichtigen Vorgängen in der Zelle wie Replikation, Transkription und Reparatur möglich. Etoposid hemmt Topo-II, indem es einen Komplex stabilisiert, in dem die Topo-II mit dem erzeugten DSB der DNA verbunden vorliegt. Eine Religation des DSB kann nicht mehr erfolgen. Etoposid wird als Mono-Chemotherapeutikum und wegen der strahlensensibilisierenden Wirkung in Kombination mit einer Strahlentherapie erfolgreich in der Tumortherapie eingesetzt. Die Versuche der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Homologe Rekombination durch Etoposid gehemmt wird. Das Nichthomologe Endjoining dagegen weist keine signifikante Beeinflussung auf. Diese Erkenntnisse könnten den synergistischen therapeutischen Effekt von Etoposid in Kombination mit Strahlentherapie erklären und somit zu einer Verbesserung der Therapie von Krebserkrankungen beitragen.