Die Bestimmung des estrogenen Potentials von Morinda citrifolia L. unter Verwendung einer Kombination aus einem Rezeptorbindungstest und einem Alkalische Phosphatase- Induktionstest in Ishikawa Zellen.

Abstract

In dieser Arbeit wurden Pflanzenextrakte von Morinda Citrifolia L. sowie ausgewählte Inhaltsstoffe der Früchte auf ihr estrogenes Potential hin anhand von zwei verschiedenen Testverfahren untersucht. Während mit Hilfe des ER-Bindungstests die Bindungsaffinitäten bzgl. der Estrogenrezeptoren α und β bestimmt wurden, diente der AP-Assay in Ishikawa-Zellen dazu, eine auf die Rezeptorbindung folgende intrinsische Aktivität in Form eines Anstieges der Aktivität der alkalischen Phosphatase nachzuweisen. Bei der Untersuchung eines Hexan-Extraktes des Frucht-Pürees von Morinda Citrifolia L. fanden wir deutliche Affinitäten zu ER-α und ER-β, die den EC50-Werten der meisten Phytoestrogene entsprachen. Bei dem im Anschluß durchgeführten AP-Assay zeigte sich ebenfalls eine Aktivität, aber erst bei relativ hohen Konzentrationen. Die Strukturaufklärung der nach Auftrennung in der HPLC und Testung der einzelnen Fraktionen im ER-Bindungs-test mit der größten Affinität zu den Estrogenrezeptoren imponierenden Substanz erbrachte die (2E,4Z,7Z)-Dekatriensäure. Die Testung dieser Substanz, welche strukturell zu den ungesättigten Fettsäuren zu zählen ist, ergab eine deutliche Aktivität im ER-Bindungstest bei negativem AP-Assay. Auch bei den im Anschluß aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit getesteten Fettsäuren fanden wir relativ hohe Affinitäten zu ER-α und ER-β, jedoch keine intrinsische Aktivität. Da sich hier ein Artefaktphänomen des ER-Bindungstests darzustellen schien, schlossen wir weitere Inhaltsstoffe von Morinda citrifolia L. in unsere Unter-suchungen ein, um die Aussagekraft der beiden verwendeten Testverfahren im allgemeinen und insbesondere bei der Erforschung dieser Pflanze zu ergründen: So erbrachte die Ursolsäure zwar in beiden Testverfahren negative Ergebnisse, offenbarte jedoch eine Fehlerquelle im Estrogenrezeptor-Bindungstest. Es scheint, als würde die Ursolsäure bei höheren Konzentrationen ausfallen und Mikrokristalle bilden, die dann zusammen mit dem lipophilen Estradiol direkt an Hydroxylapatit binden, was dann fälschlicherweise als Rückgang der kompetitiven Rezeptorbindung gewertet wird. Auch der negative Ausfall des AP-Assays ist möglicherweise auf die Bildung von Mikrokristallen zurückzuführen, woraus eine Schädigung und damit Hemmung der Zellfunktion resultieren könnte. Scopoletin, welches sowohl in unserer Arbeitsgruppe sowie von anderen Arbeitsgruppen in Morinda Citrifolia L. nachgewiesen wurde, zeigte eine sehr schwach ausgeprägte Bindung an die ER, wogegen die Induktion der AP-Aktivität deutlich ausfiel. Diese Wirkung ließ sich mit dem ER-Antagonisten ICI hemmen, was für eine ER abhängige Wirkung des Scopoletins spricht. Für die Diskrepanz der beiden Testsysteme können wir derzeit keine Erklärung anbieten. Abschließend kommen wir zu dem Ergebnis, dass der ER-Bindungstest durch verschiedene Artefaktphänomene zu falsch positiven oder auch falsch negativen Ergebnissen führen kann und daher nur in Kombination mit einem weiteren biologischen Test geeignet ist, eine zuverlässige Aussage zu treffen. Für die Anwendung dieses Tests sprechen jedoch die einfache Durchführung und die damit hohe Praktikabilität. Nachdem wir somit Artefakt-phänomene des ER-Bindungstests im Sinne von sowohl zu hoch als auch zu niedrig gemessenen Ergebnissen gefunden hatten, zeigte die abschließende Testung der ebenfalls in Morinda Citrifolia L. nachgewiesenen Flavonoide Quercetin und Kämpferol positive Ergebnisse in beiden Testverfahren, wobei für Quercetin eine je nach vorherrschender Estrogenkonzentration agonistische oder antagonistische Wirkung resultierte. Dies ist insofern von großer Bedeutung, da Quercetin ebenso wie Kämpferol in der Nahrung weit verbreitet und somit in der Lage ist, in Lebensumständen mit besonderen hormonellen Anforderungen wie beispielsweise Schwangerschaft oder Postmenopause an einer aus-gewogenen Hormonhomöostase mitzuwirken.

Extracts of the fruits of Morinda citrifolia L. (Noni) as well as selected compounds occurring in this plant were tested in the present dissertation with respect to their activity in two in vitro assays, the estrogen receptor binding assay (ER-binding assay) and the induction of alkaline phospahatse in Ishikawa cells (AP-assay). The former test proves the affinity of test compounds to ER-α and ER-β, whereas the intrinsic activity is received by the latter test. The investigation of a hexane extract prepared from Noni fruits showed a significant affinity to the estrogen receptors in the ER-binding assay. The AP-assay resulted also in a positive reaction, although only at high concentrations of the extract in the tissue culture medium. Testing of different fractions obtained by an HPLC chromatography on a reversed phase column resulted in the identification of (2E,4Z,7Z)-decatrienoic acid as the most active fraction. Investigation of the isolated compound in the ER-binding assay confirmed the results obtained with the hexane extract, however, no activity of the compound could be observed in the AP-assay. The investigation of a variety of structurally related unsaturated fatty acids, present in almost every food, showed also positve effects in the ER-binding assay. None of these compounds did show acitivity in the AP-assay. We therefore hypothesize that the positive effects obtaind in the ER-binding assay are artefactual. This hypothesis is also confirmed by the complete absense of structural elements of the fatty acids important for the binding to the ER. Other ingredients of Noni fruits were also tested in the two test assays in order to further investigate the sensitivity of these sytems. Ursolic acid, which was negative in both assays, nevertheless showed another shortcoming of the ER-binding assay. Negative binding values were obtaind with increasing concentrations of the compound in the assay. It could be demonstrated that the binding of redioactive estradiole to the solid phase of hydroxyapatit was also present in the absense of ER. This suggests the formation of a macromolecular complex of estradiol with ursolic acid micelles in a hypersaturated solution. Scopoletin, another ingredient of Noni fruits, was clearly positive in the AP-assay, whereas the ER-binding assay was only weakly active. The fact that the activity in the AP-assay could be almost completely reversed by addition of ICI, an ER-antagonist, suggests that the activity is mediated via an ER dependent pathway. No reason for the discrepancy of the two assays can be given at this time. The Noni fruit ingredients quercetin and kaempferol, flavonoids which are widely distributed in plant derived food, showed positve effects in both assays. The affinity of kaempferol to ER-α and ER-β and the intrinsic activity in the AP-assay were higher compared to quercetin. The latter compound, on the other hand, showed antagonistic activity at higher concentrations in the presence of kaempferol or estradiol. This is important, because of the presence of this compound in many food sources. Depending on situations with special hormonal require-ments, such as menopause or pregnancy, the compound could help to balance the hormonal homeostatsis.