LDL-Cholesterin als potenzieller Regulator der Cholesterin-induzierbaren Bindung von Annexin 6 an späte Endosomen

Abstract

Annexin 6 gehört zu einer Familie konservierter Proteine, die Ca2+-abhängig an Phospholipide bindet. An der Zelloberfläche stimuliert Annexin 6 die LDL-Rezeptor-abhängige Endocytose. Innerhalb des endosomalen Membrantransports stimuliert Annexin 6 das targeting von LDL in die Lysosomen. Dies geht einher mit einer Translokation von Annexin 6 in prelysosomale Zellkompartimente. Da neuere Arbeiten auf einen Einfluss von Cholesterin bei der intrazellulären Lokalisation von Annexinen schließen lassen, wurde in dieser Arbeit der Einfluss von LDL- Cholesterin auf die Lokalisation von Annexin 6 untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein experimentelles System etabliert, dass Studien zur Lokalisation von Annexin 6 in Abhängigkeit unterschiedlicher Cholesterin-konzentrationen in endosomalen Kompartimenten erlaubte. Dazu wurde der Wirkstoff U18666A verwendet, welcher die Degradation von LDL und den Abtransport von LDL-Cholesterin aus Lysosomen inhibiert. Subzelluläre Fraktionierungen, Immunfluoreszenzmikroskopie und biochemische Analysen bestätigten eine drastische Cholesterinakkumulation in späten Endosomen von Kontroll- und Annexin 6 überexprimierenden CHO-Zellen. Während in unbehandelten Zellen das Annexin 6 vor allem im Cytosol, der Plasmamembran und in frühen Endosomen lokalisiert ist, kommt es nach U18886A-induzierter Cholesterinakkumulation zu einer Translokation von Annexin 6-Proteinen in späte Endosomen. Westernblot-Analysen endosomaler Membranfraktionen bestätigten diese Ergebnisse. In vitro Bindungstudien von frühen und späten Endosomen (+/- Cholesterin) und rekombinanten Annexin 6 zeigen ebenfalls eine erhöhte Membranbindung von rekombinantem Annexin 6 vor allem an cholesterinreiche späten Endosomen. Im Gegensatz reduziert der Cholesterin Entzug die Membranaffinität von Annexin 6. Studien mit einer C-terminal-Annexin 6-Deletionsmutante weisen darauf hin, dass die Cholesterin-sensitive Bindung von Annexin 6 über seinen N-terminalen Teil vermittelt wird. Zusammenfassend deuten diese Experimente darauf hin, dass die Konzentration und Verteilung des zellulären Cholesterins die Lokalisation und Reorganisation Calcium-abhängiger und -unabhängiger Pools von Annexin 6 beeinflusst.