Untersuchung der physiologischen Rolle von Kv7.2-Kanälen und der pathophysiologischen Mechanismen von Kv7.2-Kanaldefizienz im Gehirn der Maus (Mus musculus, Linnaeus 1758)

Abstract

Mutationen in den humanen KCNQ2- und KCNQ3-Genen, welche für M-Kanaluntereinheiten (Kv7.2 und Kv7.3) kodieren, sind mit einer benignen Form von Epilepsie bei Neugeborenen (BFNC) assoziiert. In unserem Labor wurde ein transgenes Mausmodell generiert, das neuronenspezifisch und induzierbar eine dominant-negative Kv7.2-Untereinheit exprimiert. Die Suppression des M-Stroms führte zu neuronaler und Netzwerk-Übererregbarkeit, Verhaltenshyperaktivität, spontanen Anfällen und morphologischen Veränderungen, die sich in Dispersion und Displazierung von CA1-Pyramidenzellen zeigten1. Tetrazyklinkontrollierte Restriktion der Transgenexpression deckte eine kritische Periode für die Expression funktioneller Kv7.2-Kanalunterheiten während der neonatalen Hirnentwicklung auf. Die in dieser Arbeit durchgeführte Charakterisierung dieses Mausmodells mit molekularbiologischen und proteinbiochemischen Methoden zeigte, dass der Verlust funktioneller M-Kanäle im Hippocampus mit einer verstärkten Immunantwort assoziiert war, was sich in einer erhöhten Zahl aktivierter Mikroglia und einer deutlichen Astrogliose zeigte. Die sich im Epilepsiephänotyp widerspiegelnde Störung des Gleichgewichts zwischen synaptischer Inhibition und Exzitation war nicht durch einen Verlust an GABAergen hippocampalen Interneuronen verursacht. Des Weiteren wurde in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal die Netzwerkaktivität neonataler Kontrollmäuse und M-Kanal-defizienter Mäuse (P5-7) in vivo gemessen. Es konnte gezeigt werden, dass während der Entwicklung im Kortex Spindle Bursts im beta-Frequenzbereich das dominierende Muster elektrischer Aktivität waren. Die Amplitude und die Häufigkeit dieser beta-Oszillationen waren in den transgenen Mäusen in den oberflächlichen Schichten des Kortex stark erhöht. Die dominierende Aktivität im Hippocampus neonataler Mäuse waren Sharp Waves, die unregelmäßig in CA1-Stratum radiatum zu detektieren waren. Das übererregbare Netzwerk der epileptischen Mäuse konnte durch Verringerung der intrazellulären Chlorid-Konzentration mit Hilfe des NKCC1-Antagonisten Bumetanid in akuten in vivo Messungen vermindert werden. Die chronische Behandlung mit Bumetanid während der kritischen neonatalen Periode verhinderte sowohl die morphologischen Veränderungen und Inflammation des Hippocampus als auch die Verhaltenshyperaktivität und könnte daher eine aussichtsreiche Behandlungsalternative für neonatale Epilepsie insgesamt darstellen.

Mutations in the human genes KCNQ2 and KCNQ3, encoding the M-channel subunits Kv7.2 and Kv7.3, are associated with benign familial neonatal epilepsy (BFNC). We developed a transgenic mouse model that allows the neuron-specific expression of a dominant-negative Kv7.2-subunit controlled by the Tet-off system. The resulting loss of functional M-current leads to neuronal and network hyperexcitability, behavioural hyperactivity, and spontaneous seizures. Morphologically, M-current suppression leads to displacement and dispersion of CA1 pyramidal cells. Tet-off-mediated restriction of transgene expression uncovered a critical role for M-channel function during neonatal brain development. Molecular biological characterization in hippocampal tissue showed that neonatal M-current suppression in this model was accompanied by an increase immune response which was evidenced by an increase in activated microglia and astrogliosis. The altered balance between synaptic inhibition and excitation, which causes seizures and chronic epilepsy, was not caused by a reduction in the number of specific GABAergic interneurons. For the first time, the present study shows the analysis of in vivo network activity from neonatal control and mutant mice (P5-7). We show that spindle bursts in the beta frequency range are the predominant electrical activity pattern in the developing cortex. These beta oscillations were increased in amplitude and occurrence within the superficial cortical layers of mutant mice. Recordings from the hippocampus showed irregular occurring patterns of sharp wave activity in the CA1 area of neonatal mice. Pharmacological approaches lowering the intracellular concentration of chloride by selectively blocking the chloride transporter NKCC1 with the drug bumetanide proved to be successful. In acute in vivo recordings, treatment with bumetanide led to attenuation of cortical network activity in mutant animals. Furthermore, chronic treatment of mutant animals with bumetanide during the neonatal period prevented hippocampal morphological changes and the development of an epileptic phenotype as seen in untreated mutant animals. By identifying the physiological basis underlying the pathology in neonatal M-channel-deficient mice and by successfully treating these mice with bumetanide, we have shown that NKCC1 has a great potential to be a therapeutic target for the treatment of neonatal epilepsies.