Die Rolle Zytoskelett-assoziierter Proteine bei der L1-vermittelten Neuritogenese und dem Neuritenwachstum

Abstract

Das Protein L1 gehört zur Familie der neuralen Zelladhäsionsmoleküle, die neben ihrer Funktion als Adhäsionsmoleküle auch als Signaltransduktoren wirken. Es spielt eine wichtige Rolle bei der neuronalen Entwicklung, Migration, Neuritogenese, dem Neuritenwachstum und der axonalen Wegfindung. Im Rahmen dieser Dissertation sollten die zellulären Prozesse, die die L1-vermittelte Neuritogenese und das Neuritenwachstum steuern, untersucht werden. Ziel der Arbeit war es, zu klären, wie L1 die Dynamik des Zytoskeletts steuert und somit Einfluss auf Form und Funktion des Neurons nimmt. In diesem Zusammenhang wurden Lis1, die Rho-GTPasen Rac1, Cdc42 und RhoA sowie Cofilin näher untersucht. Das Mikrotubuli-assoziierte Protein Lis1 ist an der L1-vermittelten Neuritogenese beteiligt[260]. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte der zu Grunde liegende Mechanismus weiter aufgeklärt werden. Aufgrund experimenteller Probleme war dies jedoch nicht möglich. Es ergaben sich allerdings Hinweise, dass das Protein Nde1, ein Interaktionspartner von Lis1, ebenfalls an der L1-vermittelten Neuritogenese beteiligt ist. Zudem wurde gezeigt, dass sowohl Lis1 als auch Nde1 und das potentielle Adapterprotein DCX nicht direkt mit L1 interagieren. Der Einfluss von Lis1 und Nde1 auf die Neuritogenese muss also durch andere, bisher unbekannte Proteine vermittelt werden. Rho-GTPasen sind wichtige Regulatoren des Aktin-Zytoskeletts. Durch Co-Immunpräzipitationen und Immunfärbungen konnte gezeigt werden, dass die Rho-GTPasen Rac1 und Cdc42 mit L1 interagieren (S. Gensler/C. Dotti, Universität Leuven, pers. Mitteilung). Nach den in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Daten wirkt sich ein Fehlen von L1 im Mausgehirn nicht auf die Aktivität von Rac1 und Cdc42 aus. Auch die Expression von Rac1 und Cdc42 in L1-defizientem Mausgehirn unterscheidet sich nicht von der im Gehirn wildtypischer Mäuse. Die Untersuchung der Rac1- und Cdc42-Aktivität in mit einem L1-Antikörper stimulierten Kleinhirnneuronen und Neuroblastom-Zellen zeigte hingegen, dass Rac1 in die L1-Signaltransduktion von Neuroblastom-Zellen, nicht aber in die von Kleinhirnneuronen involviert ist. Für Ccd42 kann aufgrund der geringen Anzahl an Messwerten diesbezüglich keine Aussage getroffen werden. Ferner konnte gezeigt werden, dass RhoA an der Regulation der Oberflächenlokalisation von L1 beteiligt ist. Durch Inhibition von RhoA wurde der Anteil von L1 an der Zelloberfläche am Gesamt-L1-Gehalt erhöht. Zudem wirkte sich der Einsatz des Inhibitors positiv, jedoch nicht spezifisch, auf die L1-abhängige Neuritogenese aus. Diese Daten bestätigen eine Beteiligung der Rho-GTPasen RhoA und Rac1 an von L1 ausgelösten Signalwegen, die zu Neuritenwachstum und Neuritogenese führen. Cofilin ist ein Aktin-depolymerisierendes Protein, welches essentiell für die Organisation des Zytoskeletts ist. Da es wie L1 eine wichtige Rolle beim Neuritenwachstum spielt, wurde eine potentielle Interaktion der beiden Proteine untersucht. Eine Bindung von L1 an Cofilin konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit ausgeschlossen werden. Eine Stimulation von L1 durch Zugabe eines monoklonalen L1- Antikörpers, der das Neuritenwachstum fördert, bewirkte jedoch eine Aktivierung von Cofilin. Zusätzlich führte die Hemmung der Cofilin-Regulatoren LIM-Kinase und SSH-Phosphatase durch Inhibitoren zu einem verringerten L1-abhängigen Neuritenwachstum. Daraus lässt sich schließen, dass für das L1-vermittelte Neuritenwachstum ein streng regulierter Wechsel zwischen aktivem und inaktivem Cofilin essentiell ist. Darüber hinaus wurde in der vorliegenden Arbeit versucht, neben den oben genannten Proteinen weitere Moleküle zu finden, die in die L1-abhängige Neuritogenese und das Neuritenwachstum involviert sind. Dabei wurden Affinitätschromatographien und Crosslinking-Experimente durchgeführt, über die jedoch keine spezifischen Interaktionen bisher unbekannter Bindungspartner der intrazellulären Domäne von L1 nachzuweisen waren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in der vorliegenden Arbeit eine Beteiligung der Rho-GTPasen Rac1 und RhoA sowie des Aktin-assoziierten Proteins Cofilin an der zum Neuritenwachstum führenden L1-Signaltranduktion gezeigt werden konnte.

L1 belongs to the family of neural cell adhesion molecules, which, in addition to their adhesive funcion, are engaged in signal transduction pathways. L1 plays an important role in neuronal development, cell migration, neuritogenesis, neurite outgrowth and axon guidance. The aim of this study was to investigate cellular processes that regulate L1-mediated neuritogenesis and neurite outgrowth. This should lead to a better understanding of how L1 induces morphological changes of neurons. In this context, Lis1, the Rho GTPases Rac1, Cdc42 and RhoA as well as Cofilin where further examined. The protein Lis1 is involved in L1-mediated neuritogenesis and the present study aimed at clarifying the underlying mechanisms. Due to experimental problems, this unfortunately could not be accomplished. Preliminary data implicate a role of Nde1, a binding partner of Lis1, in L1-mediated neuritogenesis. Nde1, as well as Lis1 and the potential adaptor DCX do not bind to L1. Thus, the involvement of Lis1 and Nde1 in L1 signaling must be mediated by different, so far unknown proteins. Rho GTPases are important regulators of the actin cytoskeleton. Co-immunoprecipitations and immunofluorescence studies revealed an interaction of L1 and the Rho GTPases Rac1 and Cdc42 (S. Gensler/C. Dotti, University of Leuven, personal communication). As shown in this thesis, loss of L1 does not affect Rac1 and Cdc42 activity in mouse brain homogenates. Aditionally, the expression levels of Rac1 and Cdc42 in mouse brains of L1-deficient mice are not altered in comparison to wildtype brains. Analysis of Rac1 and Cdc42 activity in L1-antibody-treated cerebellar neurons and neuroblastoma cells revealed an involvement of Rac1 in L1 signaling in neuroblastoma cells but not in cerebellar neurons. Due to the limited number of data referring to Cdc42 activity, no conclusions can be made regarding the participation of Cdc42 in L1 signal transduction. Investigation of the localization of L1 at the cell surface revealed that RhoA is involved in L1 endocytosis. Inhibition of RhoA resulted in an increase of surface L1 compared to untreated cells. In addition, the RhoA inhibitor enhanced L1-mediated neuritogenesis, but in an unspecific manner. Taken together, the presented data implicate participation of Rho GTPases RhoA and Rac1 in L1 signal transduction that leads to neuritogenesis and neurite outgrowth. Cofilin is an actin-depolymerizing protein which is essential for cytoskeletal reorganization. Because it plays an important role in neurite outgrowth as L1, a potential interaction of the two proteins should be investiagted in this study. A direct interaction of L1 and Cofilin could be excluded by various binding assays. However, stimulation with a monoclonal L1-antibody known to trigger neurite outgrowth lead to Cofilin activation. Additionally, interference with LIMK kinase and SSH phosphatase function resulted in an impairment of L1-mediated neurite outgrowth. This implies that tight regulation of Cofilin activity is essential for L1-mediated neurite outgrowth. Furthermore, in the present study I searched for further L1-bindung partners as potential mediators between L1 and the cytoskeleton. For this purpose, affinity chromatography and crosslinking experiments were performed, but no specific interactions with the L1 intracellular domain could be detected. In conclusion, this study showed a participation of the Rho GTPases Rac1 and RhoA as well as the actin-associated protein Cofilin in L1 signaltransduction that leads to neurite outgrowth.