Molecular phylogenetic analyses of Bryozoa, Brachiopoda, and Phoronida

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit ist mittels molekulargenetischer Analysen die phylogenetische Stellung der lophophoraten Linien, d.h. der ektoprokten Bryozoen, der Brachiopoden und der Phoroniden, aufzudecken. Der zentrale Forschungsbericht ist in Kapitel gegliedert, die in Fachzeitschriften publizierten oder zur Veröffentlichung eingereichten Manuskripten entsprechen. Im Rahmen der ersten Studie wurden partielle Sequenzen von sieben nukleären Haushaltsgenen mittels PCR in sieben Vertretern der ektoprokten Bryozoen, Brachiopoden, Phoroniden und Chaetognathen bestimmt. Den phylogenetischen Analysen dieses Datensatzes zufolge — und gut gestützt durch Topologie-Tests — sind die lophophoraten Linien näher mit Mollusken und Anneliden verwandt als mit Deuterstomiern. Zwar legt die Studie auch die Polyphylie dieser Taxa nahe, jedoch erwiesen sich die Daten sowohl als ungenügend, die phylogenetische Position der Chaetognathen zu bestimmen, als auch die verwandtschaftlichen Beziehungen zwischen den Lophophoraten oder den Lophotrochozoen im Allgemeinen aufzuklären. Infolgedessen wurde dieser Ansatz zugunsten der EST-Technik verworfen. Mehr als 4000 “Expressed Sequence Tags” (ESTs) des cheilostomen Ektoprokten Flustra foliacea flossen in eine zweite Studie ein. Unter Einsatz zusätzlicher EST-Projekte und Zugriff auf öffentliche Datenbanken wurde ein Alignment erstellt, das Sequenzen von 79 ribosomalen Proteinen aus 38 Taxa enthielt. Maximum-Likelihood und Bayes’sche Analysen basierend auf diesem Datensatz zeigen die Monophylie der Bryozoa einschließlich Ectoprocta und Entoprocta, zweier Taxa, die aufgrund scheinbar tief greifender morphologischer Unterschiede vor über einem Jahrhundert getrennt wurden. Diese und andere Ergebnisse legen nahe, dass klassische ontogenetische und morphologische Schlüssel-Merkmale wie Furchungsmuster, Coelomräume, Architektur des Darms und Segmentierung im Lauf der Evolution Gegenstand größerer Plastizität sind als traditionell angenommen. Die Erweiterung dieses Datensatzes um jeweils 2000 ESTs des craniiformen Brachiopoden Novocrania anomala und des Phoroniden Phoronis muelleri führte zur Publikation einer dritten Studie. Dieser Untersuchung zufolge müssen alle drei lophophoraten Linien eindeutig innerhalb der Lophotrochozoa platziert werden. Deren Monophylie konnte jedoch nicht bestätigt werden; stattdessen zweigen Ekto- und Entoprokten vermutlich an der Basis der Lophotrochozoen ab, während die robust zu Brachiozoa vereinigten Brachiopoden und Phoroniden näher mit Anneliden, Mollusken und Nemertinen verwandt zu sein scheinen. Diese Ergebnisse sind kongruent zu sorgfältigen Neubewertungen jener morphologischer Merkmale, die traditionell verwendet werden, um die nähere Verwandtschaft der Lophophoraten zu den Deuterostomiern zu untermauern, z.B. Archimerie, der Besitz eines mesodermalen Tentakel-Apparats und der Modus der Mesoderm-Bildung. Nachdem eine robuste Auflösung zwischen den Stämmen noch immer nicht erreicht wurde, wurden weitere EST-Projekte durchgeführt, um die Zahl der Taxa zu erhöhen. Insgesamt jeweils 2000 ESTs des cyclostomen Bryozoen Tubulipora sp. und des ctenostomen Bryozoen Alcyonidium diaphanum wurden für eine vierte Studie erhoben. Wie zuvor wurden ribosomale Protein-Sequenzen erfasst und durch entsprechende Daten aller bis dato verfügbaren Bryozoen, Brachiopoden und Phoroniden ergänzt. Um den potentiellen Einfluss heterogener Aminosäure-Zusammensetzung zu mindern, wurden mehrere Ansätze verfolgt. Am effizientesten erwies sich die Rekodierung der Aminosäuren in Gruppen funktioneller Ähnlichkeit, wodurch weitere Belege für die Monophylie der Bryozoen und der Brachiozoen erbracht werden konnten. Obwohl Verwandtschaftsverhältnisse innerhalb beider Taxa ebenfalls beleuchtet werden konnten, bleiben die Beziehungen zwischen den Stämmen der Lophotrochozoen dennoch schlecht unterstützt, was die Vorstellung nährt, dass diese Gruppe im Präkambrium durch eine schnelle Folge kladogenetischer Ereignisse entstand. Da Paralogie eine weiteres Problem in der phylogenetischen Rekonstruktion darstellt, wurde in einer fünften Studie ein neuartiger, phylogenetischer Ansatz zur Evaluation von Homologie-Verhältnissen von Genen vorgestellt. Mithilfe eines automatisierten Arbeitsablaufs wurden Gen-Bäume ribosomaler Proteine rekonstruiert, und jedes Gen einer von dreien Kategorien zugeteilt, die Grade unterschiedlicher Beweiskraft für Orthologie oder Paralogie repräsentieren. Dadurch konnte der Großteil der ribosomalen Proteine als geeignet identifiziert werden, die Stammesgeschichte der Bilateria zu untersuchen. Eine abschließende, umfassende phylogenetische Analyse, die sich auf diese Gene beschränkt, bestätigt die zentralen Ergebnisse der vorherigen Studien und zeigt, dass diese nicht durch paraloge Genkopien beeinflusst wurden.

The present thesis focuses on molecular and computational analyses to elucidate the phylogenetic position of the lophophorate lineages, i.e., ectoproct bryozoans, brachiopods, and phoronids. Its main section is organized in chapters corresponding to manuscripts that have been published in or submitted to scientific journals. For the first manuscript, “Multigene analysis of lophophorate and chaetognath phylogenetic relationships”, seven nuclear housekeeping gene fragments of seven representatives of ectoproct bryozoans, brachiopods, phoronids, and chaetognaths were PCR amplified and sequenced. According to phylogenetic analyses based on this dataset — and strongly supported by topology tests — the lophophorate lineages are more closely related to molluscs and annelids than to deuterostomes. While this study also suggests that they are polyphyletic, the data was neither sufficient to place chaetognaths, nor to robustly resolve the phylogenetic relations among lophophorates or among lophotrochozoans in general. Consequently, this approach was abandoned in favour of EST sequencing. More than 4000 expressed sequence tags (ESTs) of the cheilostome ectoproct Flustra foliacea were incorporated into a second study, “Spiralian phylogenomics supports the resurrection of Bryozoa comprising Ectoprocta and Entoprocta.” Accessing additional EST projects and public archives, a super-alignment derived from 79 ribosomal protein gene sequences of 38 metazoan taxa was compiled. Maximum likelihood and Bayesian inference analyses based on this dataset indicate the monophyly of Bryozoa including ectoprocts and entoprocts — two taxa that have been separated for more than a century due to seemingly profound morphological differences. These and other findings suggest that classical developmental and morphological key characters such as cleavage pattern, coelomic cavities, gut architecture and body segmentation are subject to greater evolutionary plasticity than traditionally assumed. This dataset was further complemented by 2000 ESTs each of the craniiform brachiopod Novocrania anomala and the phoronid Phoronis muelleri, leading to the publication of the third study, “Phylogenomic analyses of lophophorates (brachiopods, phoronids and bryozoans) confirm the Lophotrochozoa concept.” According to this analysis, all three lophophorate lineages are clearly to be placed within Lophotrochozoa. Their monophyly, however, was not recovered; instead, ectoprocts and entoprocts presumably branch off at the lophotrochozoan base, while brachiopods and phoronids, robustly united to Brachiozoa, appear to be more closely allied to molluscs, annelids, and nemertines. These results are congruent with recent and careful re-evaluations of morphological characters traditionally used to unite lophophorate taxa with deuterostomes, e.g., archimery, possession of a mesodermal tentacular apparatus and the mode of mesoderm formation. With robust interphyletic resolution still lacking, additional EST projects were performed to improve the taxon sampling within Lophotrochozoa. A total of 2000 ESTs each of the cyclostome bryozoan Tubulipora sp. and the ctenostome bryozoan Alcyonidium diaphanum were generated for the study “Reducing compositional heterogeneity improves phylogenomic inference of lophotrochozoan relationships.” Again, ribosomal protein sequences were retrieved and supplemented by all data available of bryozoan, brachiopod, and phoronid taxa to date. To mitigate the potential impact of compositional heterogeneity displayed by metazoan taxa, several approaches were applied to reduce this trait. Among these, recoding amino acids into groups of functional interchangeability proved to be the most efficient, and provides further evidence for the monophyly of Bryozoa and Brachiozoa. Although internal relations of both taxa could also be elucidated, most interphyletic relationships within Lophotrochozoa remain nevertheless poorly supported, nourishing the idea that this group underwent a rapid series of cladogenetic events in the Precambrium. As paralogy has been identified as another pitfall of phylogenetic inference, a novel, phylogenetic approach to evaluate gene homology relations is finally proposed in „Tree-based orthology assessment illustrated by the evaluation of ribosomal protein genes.” By reconstructing gene trees of ribosomal proteins gathered from genomic datasets using an automated pipeline, and assigning each gene to one of three categories representing varying degrees of evidence for orthology or paralogy, most ribosomal protein genes were identified as suitable for the reconstruction of bilaterian phylogeny. A final, comprehensive phylogenetic analysis restricted to these genes confirms the central results of the previous phylogenetic studies, emphasising that these were not misled by artefacts related to paralogy.