Poly(ethylene glycol)-conjugated Alkylamines as Novel Blocking Reagents for Immunoassays

Abstract

Blocking reagents represent an essential albeit not widely studied part of solid phase supported immunoassays. The development of novel blocking reagents was the main purpose of this thesis. In this regard, poly(ethylene glycol)-conjugated alkyl amines, which are typical surfactants with up to now mainly industrial applications, were studied as candidates for novel blocking reagents in immunoassays for the first time. First, a variety of poly(ethylene glycol)- conjugated alkyl amines was synthesised. Second, the blocking performance of the synthesised surfactants was investigated in assay experiments. A modular synthesis was designed that permitted the efficient preparation of poly(ethylene glycol)-conjugated alkyl amines of different structures. Notably, one or two poly(ethylene glycol)-groups could be linked to one or two alkyl chains, both of variable length, via a short and simple bridge. Moreover, one or two amine groups could be inserted between the bridge and the poly(ethylene glycol)-group and/or terminally appended on the hydrophobic side. The synthesised substances were successfully characterised, which included the determination of the solubility and the critical micelle concentration. The synthesised surfactants were subjected to a number of different assay experiments. Preliminary assays showed that cationic surfactants perform best under standard assay conditions such as neutral pH value and physiological ion concentrations. In three distinct ELISA formats the blocking performance of the synthesised surfactants was compared to that of commercially available blocking reagents. It was found that no single commercially available blocking reagent was able to achieve both good specificity and sensitivity. On the other hand, many of the PEG-conjugated alkylamines were able to combine acceptable specificity and sensitivity and some yielded very good results in both respects in all assay experiments. In conclusion, the best synthesised surfactants outperform the blocking reagents that are commercially available to date. In addition, they do not exhibit any of the drawbacks of proteinaceous blocking reagents, such as cross-reactivity, heterogeneity and lot-to-lot variability. Since these novel blocking reagents achieved very promising results, a commercialisation is hoped for in the near future. Though further research is obviously needed, industrial preparation of the compounds should be feasible and enable a cost-efficient production.

Blockierungsreagenzien stellen zwar eine unentbehrliche Komponente eines Festphasenassays dar, sind dafür jedoch vergleichsweise schlecht erforscht. Die Entwicklung neuer Blockierungsreagenzien war daher das zentrale Anliegen dieser Arbeit. Daher wurden Poly(ethylenglycol)-konjugierte Alkylamine, eine Klasse von Tensiden, die bislang hauptsächlich in der Industrie Verwendung findet, erstmals bezüglich ihrer Eignung als Blockingreagenzien für Immunoassays studiert. Im ersten Schritt wurde eine Reihe von Poly(ethylenglycol)-konjugierten Alkylaminen dargestellt, und im zweiten Schritt wurden die synthetisierten Tenside mit Hilfe von Festphasenassays auf ihre Blockierungseigenschaften untersucht. Es wurde eine modulare Baukasten-Synthese entworfen, mit Hilfe deren Poly(ethylenglycol)- konjugierte Alkylamine verschiedenster Struktur effizient dargestellt werden konnten. Diese Synthese ermöglichte die Herstellung von Tensiden mit jeweils einer oder zwei Poly(ethylenglycol)-Gruppe(n) und Alkylkette(n) unterschiedlicher Länge, die über eine kurze Brücke miteinander verbunden sind. Die Synthesestrategie erlaubte weiterhin den Einbau von einer oder zwei Aminogruppe(n) zwischen der Poly(ethylenglycol)-Gruppe und der Brücke und/oder am Ende der Alkylkette. Die synthetisierten Substanzen wurden erfolgreich charakterisiert, dabei wurden unter anderem Löslichkeit und kritische mizellare Konzentration bestimmt. Die synthetisierten kationischen Tenside wurden mit Hilfe unterschiedlicher Festphasenassays untersucht. In einer Reihe von Voruntersuchungen wurde gezeigt, dass kationische Tenside optimal unter üblichen Assaybedingungen, wie z.B. neutralem pH-Wert oder physiologischen Ionenkonzentrationen, arbeiten. Drei unterschiedliche ELISA-Formate wurden angewandt, um die Blockierungseigenschaften der kationischen Tenside mit denen kommerziell erhältlicher Blockierungsreagenzien zu vergleichen. Dabei stellte sich heraus, dass keines der kommerziell erhältlichen Reagenzien sowohl gute Spezifität als auch gute Sensitivität bieten konnte. Hingegen waren viele der synthetisierten Reagenzien in der Lage, angemessene Blockierungseigenschaften sowohl in Hinsicht der Sensitivität als auch der Spezifität zu gewährleisten. Einige der kationischen Tenside konnten in dieser Hinsicht sehr gute Ergebnisse in allen drei ELISA-Formaten erzielen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die besten Vertreter der synthetisierten Tenside kommerziell erhältliche Blockierungsreagenzien in ihren Blockierungsfähigkeiten übertreffen. Synthetische Blockierungsreagenzien auf Basis Poly(ethylenglycol)-konjugierter Alkylamine schließen des Weiteren viele Nachteile aus, die bei proteinhaltigen Blockierungsreagenzien auftreten, wie z.B. Kreuzreaktivität, Heterogenität, Verderblichkeit, Chargenunterschiede, etc. Die vielversprechenden Ergebnisse dieser Arbeit lassen eine baldige Kommerzialisierung der neuartigen Blockierungsreagenzien erhoffen. Auch wenn weitergehende Untersuchungen sicherlich nötig sind, sollte eine industrielle Produktion der kationischen Tenside kostengünstig möglich sein.