Reverse and Forward Genetic Approaches for the Development of Disease Resistant Wheat (Triticum aestivum L.)

Abstract

Wheat (Triticum aestivum L.) is one of the most important crops of the world and ranks first in the area covered worldwide and second after maize in production. It is prone to many diseases the most important of which are fungi. For example, fusarium head blight (FHB) and powdery mildew (PM) of wheat are the destructive diseases of wheat especially in the cool and humid areas of the world. Classical wheat breeding programmes have produced some cultivars that resist against FHB and PM to some extent. But due to the ever mutating pathogens and vertical nature of the resistance these cultivars also become susceptible after a few years. The development of the genetic engineering has given a passage to the scientists and wheat breeders to look for the ways that can help them to develop a genotype which can stably resist against more than one pathogen with non race specificity. For this purpose it was decided i) to co-express two antifungal genes (HarChit and HarCho) under constitutive Ubi and stress/disease inducible Vst1 promoter and ii) knock down three members (Ta-GSL3, Ta-GSL8 and Ta-GSL-10) of Glucan Synthase Like gene family in order to find out their role in disease resistance. A total of 9 lines were developed with co-integration and expression of HarChit and HarCho under constitutive Ubi promoter (4 lines) and inducible Vst promoter (5 lines). The integration pattern showed single copy as well as multi-copy integration of both the genes. The copy number varied for HarChit (1-3) and HarCho (2-10). Inducible promoter seemed to have no affect on transformation. Pathological testing showed a decrease in the susceptibility for both the pathogens tested. For Erysiphe. Graminis (E. graminis) a decrease in susceptibility was seen upto 75% while for Fusarium. graminearum (F. graminearum) the decrease in susceptibility was seen upto 58%. All the primary transforments with the exception of a couple showed normal growth. Only 4 (No plant for Ta-GSL10) transgenic lines were found for the knock down of GSL genes and that too when siRNA forming DNA fragments of around 150 bp were used in the RNAi constructs. No transgenic plant was found when larger siRNA forming DNA fragments were used in the RNAi constructs. Out of 4 plants only two (1 for GSL3, 1 for GSL8) showed a reduction in gene expression in T0 and T1 generations. Pathological analysis with F. graminearum showed an increase in disease susceptibility of up to 60% for Ta-GSL3 knock down and 40% for Ta-GSL8 knock down. This shows the involvement of both of these genes in disease resistance. Due to the difficulty in getting knock down lines using RNAi cassettes under constitutive promoter, it was decided to find out disease inducible genes in wheat. Four genes inducible under disease infection were identified in wheat under F. graminearum infection; the corresponding promoter of those can be identified and used in future transformation experiments.

Weizen (Triticum aestivum L.) stellt eines der wichtigsten Getreide der Welt dar. T. aestivum weist die größte Anbaufläche weltweit auf und ist nach Mais am zweitwichtigsten in der globalen Getreideproduktion. Weizen ist anfällig für viele Krankheiten, die meistens durch Pilze ausgelöst werden. In kalten und feuchten Klimazonen sind zum Beispiel Ährenbleiche Fusarium Head Blight (FHB) und echter Weizenmehltau Auslöser ertragsmindernder Krankheiten. Mit Hilfe von klassischen Züchtungsprogrammen konnten Sorten entwickelt werden, welche begrenzt Resistenzen gegen FHB oder echtem Weizenmehltau aufwiesen. Aufgrund der mutierenden Pathogene und der vertikalen Natur der Resistenz sind diese Sorten nach einigen Jahren wieder anfällig für diese Pathogene. Die Fortschritte in der Gentechnik eröffnen den Wissenschaftlern und Pflanzenzüchtern neue Wege, um Genotypen zu entwickeln, welche eine stabile Resistenz gegen mehrere Pathogene ohne Artspezifität aufweisen. Um dies zu erreichen wurden in dieser Arbeit zwei unterschiedliche Ansätze verfolgt. Zum einen wurden zwei antifungale Gene (HarChit und HarCho) unter der Kontrolle eines konstitutiven Ubi-Promotors und eines Stress-induzierbaren Vst-Promotors koexprimiert. Zum anderen wurden drei Mitglieder (GSL3, GSL8 und GSL-10) der Glucan-Synthase-Ähnlichen-Genfamilie ausgeschaltet, um deren Funktion in der Krankheitsresistenz zu untersuchen. Insgesamt konnten neun transgene Linien regeneriert werden, welche eine Kointegration und Expression der Gene HarCHit und HarCho aufwiesen. In vier Linien wurden diese Gene durch einen konstitutiven Ubi-Promotor kontrolliert und in fünf Linien wurden diese Gene durch den induzierbaren Promotor Vst kontrolliert. (Drei transgene Regenerate enthielten nur HarChit oder HarCho.) Das Integrationsmuster wies sowohl Einzel- als auch Mehrfachintegrationen der beiden Gene auf. Die Anzahl an Kopien von HarChit (1 bis 3) und HarCho (2 bis 10) variierten. Die Verwendung eines induzierbaren Promotors schien keinen Einfluss auf die Transformation zu haben. Über Infektionsanalysen konnte eine Abnahme der Anfälligkeit gegenüber der untersuchten Pathogene beobachtet werden. Die Anfälligkeit gegenüber E. graminis sank um 75 %, wohingegen die Anfälligkeit gegenüber F. graminearum um 58 % sank. Alle Primärtransformanten, mit wenigen Ausnahmen, wiesen ein normales Wachstum auf. Bei nur vier transgenen Linien (keine für Ta-GSL-10) konnte eine Geninhibierung der GSL-Gene unter Verwendung von etwa 150 bp großen siRNAs für die DNA-Fragmente in den RNAi-Konstrukten beobachtet werden. Wurden größere siRNAs für die DNA-Fragmente in den RNAi-Konstrukte verwendet, konnten keine Pflanzen regeneriert werden. Nur zwei von vier transgenen Regeneraten (1 für GSL3, 1 für GSL8) zeigten eine Reduktion der Genexpression in den T0- und T1-Generationen. Infektionsanalysen mit F. graminearum zeigten eine Zunahme der Krankheitsanfälligkeit bis zu 60 % bei Ta-GSL3-Inhibierung und bis zu 40 % bei Ta-GSL8-Inhibierung. Dadurch konnte der Zusammenhang zwischen diesen Genen und der Krankheitsresistenz nachgewiesen werden. Aufgrund der Schwierigkeiten der Geninhibierung unter Verwendung von RNAi-Kassetten unter der Kontrolle von konstitutiven Promotoren, wurde nach Genen gesucht, die durch Krankheiten induziert werden. Es konnten vier Gene identifiziert werden, welche durch Infektionen mit F. graminearum induziert wurden. Die Promotoren dieser Gene könnten in zukünftigen Versuchen verwendet werden.