Design, Synthese und Analyse CD4 bindender Peptide, Glycopeptide und deren Mimetika als HIV-Entry-Inhibitoren

Abstract

Die primäre Wechselwirkung des HI-Virus mit humanen Wirtszellen bietet einen vielversprechenden Ansatz zur Entwicklung von HIV-Entry-Inhibitoren. Die an dieser Wechselwirkung beteiligten Proteine sind das virale GP120-Protein und das humane CD4 Protein. Auf der Grundlage eines von J. Wülfken entwickelten Dekapeptids mit HI-Virus neutralisierenden Eigenschaften konnte A. Neffe Peptidomimetika mit verbesserten pharmakophoren Eigenschaften entwickeln. Die mittels SPR-Experimenten bestimmten Dissoziationskonstanten dieser Peptidomimetika betrugen bis zu KD = 6 µM. Ebenfalls wurde die proteolytische Halbwertszeit gegenüber dem Peptid vervierfacht. Zu Beginn der vorliegenden Arbeit wurde mittels des Programms Sybyl eine Analyse der von A. Neffe gedockten und synthetisierten Statin-modifizierten Peptidomimetika 13-15 durchgeführt. Resultierend aus diesen Ergebnissen wurden backbone-modifizierte Peptidomimetika 16-23 mittels des Programms FlexiDock an das CD4-Protein gedockt. Hierbei enthielten diese Peptidomimetika zwei unterschiedliche Modifikationen der Peptidbindung zwischen L-Valin und Glycin. Bei den Modifikationen handelte es sich um Ketomethylen-Mimetika (16-19) und E Ethylen Mimetika (20-23). Die für die Synthese der Liganden notwendigen Fmoc-geschützten Dipeptidmimetika 24 und 25 konnten, ausgehend von bereits von mir etablierten Synthesewegen, erfolgreich dargestellt werden. Die dargestellten Verbindungen 24 und 25 wurden verwendet, um zunächst die Liganden 16 und 17 in einer linearen Synthesesequenz darzustellen. Die niedrigen Ausbeuten in der Umsetzung von den Isocyanaten mit dem Alkohol 62 wurden durch ein neuartiges Synthesekonzept wesentlich verbessert. Durch Mikrowellen-unterstützte Synthese geschützter Peptidomimetika 77 und 78 sowie die Synthese der Amino Carbamate 73-76 konnten anschließend konvergent zusammengeführt werden, wodurch die Liganden 16-23 in sehr zufriedenstellenden Ausbeuten erfolgreich dargestellt werden konnten. In den anschließenden SPR-Experimenten konnten für alle acht neuartigen Peptidomimetika Bindungskurven erhalten und daraus Dissoziationskonstanten mit KD = 1 bis 6 µM bestimmt werden. Ebenfalls konnten in Verdaustudien die Halbwertszeiten der Stabilität der Liganden 18 und 22 mit 41 Minuten bzw. 58 Minuten bestimmt werden. Ausgehend von Studien an kompletten HI-Viren, in denen der Einfluss der Glycosylierung am Asn201 auf die Infektiösität nachgewiesen wurde, sind sechs unterschiedliche Peptide und Glycopeptide 81-86 erfolgreich mittels Mikrowellen-unterstützter Festphasenpeptidsynthese dargestellt worden. Es konnte mittels SPR Experimenten erfolgreich nachgewiesen werden, dass die linearen Peptide 81 und 82 keine starke Bindung zum CD4-Protein eingehen, wohingegen die Verknüpfung der Peptide 81 beziehungsweise 82 mit dem bekannten Dekapeptid wesentlich zu einer Verbesserung der Bindungsaffinität führt. Die KD-Werte für die linearen Peptide 83 und 84 konnten mit ~ 430 µM bestimmt werden. Durch die erfolgreichen SPR-Experimente mit den zyklischen Peptiden 85 und 86 konnte jedoch zusätzlich eindeutig aufgezeigt werden, dass durch die Zyklisierung, einhergehend mit einer vermutlich daraus resultierenden räumlichen Faltung der Peptide, die Bindungseigenschaft zum CD4-Protein noch einmal erheblich gesteigert werden konnte. Es konnte ein KD-Wert für das zyklische, nicht glycosylierte Peptid 85 von 91 µM bestimmt werden und für das zyklische Glycopeptid 86 ein KD-Wert von 10 µM. Es gelang erfolgreich durch eine constrained-Moleküldynamiksimulation die dreidimensionale Struktur des Glycopeptids 86 in Lösung zu erhalten. Zusätzlich gelang es, den Abstand zwischen dem im Epitop vorhandenen L-Prolin--Kohenlenstoff und dem anomeren Kohlenstoff des Glucosamins am Asn201 mit 6.34 Å zu bestimmen. Im Anschluss wurde erfolgreich die Struktur der Peptidomimetika 16-23 mit einem Glucosamin über ein Glutaminsäure-Derivat mit einem Abstand von 6.30 Å kombiniert. Dies führte zu einer neuen Klasse von Monosaccharidpeptidomimetika (91-98). SPR Experimente mit den neuen Glycopeptid-mimetischen Liganden ergaben KD-Werte von ~ 203 bis 940 nM, wobei die Bindungsaffinität mit steigendem sterischen Anspruch des hydrophoben Carbamat-Restes besser wird. Da der Einfluss der Monosaccharid-Glycosylierung auf die Affinität der Liganden 91-93 und 95-97 sehr groß zu sein schien, wurden weitere Disaccharidpeptidomimetika 124-127 entwickelt. SPR-Untersuchungen mit dem Liganden 126 ergaben einen KD-Wert von 152 nM, was einer Steigerung um den Faktor fünf in der Bindungsaffinität gegenüber dem Monosaccharidpeptidomimetikum 95 entspricht. Durch Kombination von NMR-spektroskopischen Analysen, in silico Rechnungen, SPR Untersuchungen sowie organisch, synthetischen Arbeitsmethodiken konnten nun Glycopeptidomimetika als potentielle Entry-Inhibitoren erhalten werden, deren Bindungsaffinitäten gegenüber dem CD4-Protein im Verlaufe dieser Arbeit von KD ~ 6 µM auf ~ 150 nM gesteigert werden konnten.

The primary interaction between the HI-virus and its human host cell provides a promising approach for the development of HIV-entry-inhibitors. The proteins who are involved in these interactions are the viral gp120- and the human CD4-protein. Based on a virus neutralizing decapeptide developed by J. Wülfken A. Neffe designed CD4 binding peptidomimetics with improved pharmacophoric properties. SPR experiments provided dissociations constants of these peptidomimetics down to KD = 6 µM. Relative to the peptide the proteolytic half life was increased four fold. At the beginning of this thesis in silico analysis of statine modified peptidometics 13-15, docked and synthesized by A. Neffe, were carried out using the program Sybyl. Based on these results backbone modified peptidomimetics 16-23 were docked to CD4 using the program Flexidock. Two different modifications of the peptide bond between L-valine and glycine were introduced as ketomethylene that gave peptidomimetics 16-19 and as E-ethylene derivatives that gave peptidomimetics 20-23. Starting from a synthetic strategy established earlier by me Fmoc protected dipeptide mimetics 24 and 25 could be successfully obtained. Compounds 24 and 25 were used to synthesize ligands 16 and 17 via a linear synthetic sequence. A new convergent synthetic strategy was developed employing the microwave assisted synthesis of the protected peptidomimetics 77, 78 and the amino urethane building blocks 73-76. These different building blocks were finally merged together so that final ligands 16-23 could be obtained in very satisfactory yields. SPR experiments gave binding curves for all eight ligands from which KD values of 1-6 µM were determined. The half life t1/2 of ligand 18 and 22 against digestion by Pronase could be determined with 41 minutes and 58 minutes, respectively. Several studies with complete HI viruses showed the influence of the glycosylation at the Asn201 on infectivity. Therefore, six peptides and glycopeptides were synthesized via microwave assisted solid phase peptide synthesis (81-86). SPR experiments showed that linear peptides 81 and 82 did not have a high affinity to CD4 whereas the combination of 81 or 82 with decapeptide 425NMWQKV430-G-123TPL125 led to an improvement in binding affinity. The KD values for peptide 83 and 84 could be determined to KD ~ 430 µM. SPR experiments with the cyclic peptides 85 and 86 unambiguously showed that the cyclization led to even stronger binding affinity to CD4. The KD value of the cyclic, non glycosylated peptide 85 could be determined to KD 91 µM that of the cyclic, glycosylated peptide 86 to 10 µM. Based on these results a structure of the cyclic glycopeptide 86 derived from 1H-NMR- and NOE-spectroscopic data was determined. Constrained molecular dynamic simulation gave the three dimensional structure of glycopeptide 86 in solution. From this model the distance between the -carbon of L-proline and the anomeric carbon of the essential glucosamine linked to Asn201 was derived to be 6.34 Å. Peptidomimetics 16-23 were linked with an L-glutamic acid derivative to a glucosamine with a distance of 6.30 Å. This linkage led to a new class of monosaccharide-peptidomimetics (91-98). The synthesis of ligands 91-93 respectively 95-97 could be successfully accomplished in analogy to the convergent synthesis of the ligands 16-23. Following SPR experiments of these ligands gave KD ~ 203-940 nM. Because of the influence of glycosylation by a monosaccharide to the binding affinity of ligands 91-93 and 95-97 new disaccharide-peptidomimetics (124-127) were developed. These ligands could be synthesized successfully via the already established synthetic route. SPR investigations of ligand 126 resulted in KD =152 nM, an eight fold higher value compared to monosaccharide peptidomimetic 95. By combination of NMR spectroscopic data, in silico calculations, SPR investigations as well as organic synthetisis during this thesis new glycopeptidomimetics are available, whose binding affinity against CD4 could be increased from KD = 6 µM to ~ 150 nM.