Components and Mechanisms in Diagnosis and Therapy of Hymenoptera Venom Allergy

Abstract

Anaphylaxis due to Hymenoptera stings is one of the most severe clinical outcomes of IgE-mediated hypersensitivity reactions. Although allergic reactions to Hymenoptera stings are often considered as a general model for the underlying principles of allergic disease, diagnostic tests are still hampered by a lack of specificity and venom immunotherapies by severe systemic side-effects and incomplete protection. Thus, aim of this work was the improvement of both diagnostic and therapeutic approaches by recombinant technologies. Since a recombinant availability of venom allergens might offer several promising possibilities for an improvement, novel allergenic components from Apis mellifera and Vespula vulgaris venom were identified as well as established allergens recombinantly produced and characterized in detail. With the 100 kDa allergens Api m 5 and Ves v 3 a novel cross-reactive allergen family, the dipeptidylpeptidases IV, was identified. Both enzymes were generated in recombinant form, enzymatically characterized and their relevance as major allergens in Hymenoptera venom was demonstrated by different immunological and cellular methods assessing sIgE of venom-allergic patients. For the recently identified Carbohydrate-rich protein from honeybee venom importance as sensitizing venom component in approximately 50% of venom-sensitized patients and applicability as novel surrogate marker candidate for honeybee venom sensitization were demonstrated by comparative assessment of differentially glycosylated recombinant molecules. By the recombinant production of these new allergens, as well as established allergens like Api m 2, Api m 3, Ves v 1, Ves v 2a, Ves v 2b, and Ves v 5 in insect cells it was possible to provide a broad panel of properly folded and posttranslationally modified molecules for component-resolved approaches to Hymenoptera venom allergy. Moreover, a novel diagnostic concept was introduced by the production of properly glycosylated allergens allowing reliable differentiation of protein versus cross-reactive carbohydrate determinant (CCD) reactivity and enabling identifycation of true sensitization with clinical impact. Additionally, the generation of monoclonal recombinant allergen-specific IgE, IgG and IgY antibodies could be established for application in standardization and for avoidance of assay interference in immunoassays as well as for assessment of the complex molecular interactions of allergens, specific antibodies and their receptors. By the use of monoclonal IgE antibodies we were for the first time able to detect a putatively essential allergen in A. mellifera venom and, moreover, to demonstrate its absence in various therapeutic preparations, a finding with major implications for specific immunotherapy of allergy. The results of this work demonstrate that a variety of recombinant technologies can provide novel, component-resolved concepts for the identification of clinically relevant allergens, proper allergy diagnosis and the design of adequate intervention strategies. Moreover, the newly identified and established recombinant allergens might contribute to a more detailed understanding of the molecular and allergological mechanisms of insect venoms.

Anaphylaktische Reaktionen nach Hymenopterenstichen sind eine der schwersten klinischen Erscheinungsformen IgE-vermittelter Überempfindlichkeitsreaktionen. Obgleich allergische Reaktionen auf Hymenopterenstiche häufig als Modell der zugrunde liegenden Prinzipien allergischer Erkrankungen angesehen werden, sind diagnostische Tests noch immer durch einen Mangel an Spezifität und Insektengift-Immuntherapien durch schwere Nebenwirkungen und einen unvollständigen Schutz beeinträchtigt. Das Ziel dieser Arbeit war somit die Verbesserung diagnostischer und therapeutischer Ansätze mit Hilfe rekombinanter Technologien. Da die rekombinante Verfügbarkeit der Insektengiftallergene eine Reihe viel versprechender Möglichkeiten für eine derartige Verbesserung bieten könnte, wurden neuartige Komponenten der Gifte von Apis mellifera und Vespula vulgaris identifiziert sowie etablierte Allergene rekombinant hergestellt und im Detail charakterisiert. Mit den 100 kDa Allergenen Api m 5 und Ves v 3 haben wir eine neuartige kreuzreaktive Allergenfamilie, die Dipeptidylpeptidasen IV, identifiziert. Beide Enzyme wurden in rekombinanter Form erzeugt, enzymatisch charakterisiert und ihre Relevanz als Hauptallergene in Hymenopterengiften mittels unterschiedlicher, auf spezifischen IgE-Antikörpern allergischer Patienten basierender immunologischer und zellulärer Methoden, demonstriert. Für das kürzlich identifizierte Carbohydrate-rich protein des Bienengiftes konnten wir anhand des Vergleichs differentiell glykosylierter, rekombinanter Moleküle die Wichtigkeit als sensibilisierende Giftkomponente in ungefähr 50% der Bienengift-sensibilisierten Patienten sowie die Anwendbarkeit als neuartigen Surrogatmarker Kandidaten für Bienengiftsensibilisierung demonstrieren. Durch die rekombinante Herstellung dieser neuen, als auch etablierter Allergene wie Api m 2, Api m 3, Ves v 1, Ves v 2a, Ves v 2b und Ves v 5 in Insektenzellen, war es möglich, ein breites Panel korrekt gefalteter und posttranslational modifizierter Moleküle für einen komponentenaufgelösten Ansatz im Bereich der Hymenopterengiftallergie bereitzustellen. Zusätzlich konnte die Generierung monoklonaler Allergen-spezifischer IgE-, IgG- und IgY-Antikörper für die Anwendung im Bereich der Standardisierung und zur Vermeidung von Interferenzen in immunologischen Tests sowie die Analyse der komplexen molekularen Interaktionen von Allergenen, spezifischen Antikörpern und deren entsprechenden Rezeptoren, etabliert werden. Durch die Nutzung eines solchen monoklonalen IgE-Antikörpers konnten wir erstmalig ein potentiell essentielles Allergen im Gift von A. mellifera detektieren und zusätzlich dessen Fehlen in verschiedenen therapeutischen Präparaten nachweisen; eine Entdeckung mit wichtigen Implikationen für die spezifische Immuntherapie der Allergie. Die Resultate dieser Arbeit zeigen, dass verschiedenste rekombinante Technologien neue komponentenaufgelöste Konzepte für die Identifizierung klinisch relevanter Allergene, exakte Allergiediagnose und das Design adäquater Interventionsstrategien bereitstellen können. Zudem könnten die neu identifizierten und etablierten rekombinanten Allergene zu einem detaillierterem Verständnis der molekularen und allergologischen Mechanismen von Insektengiften beitragen.