Molekulare Grundlagen von Verfärbungsprozessen im Holz der Robinie (Robinia pseudoacacia L.): Genexpressionsstudien an Schlüsselgenen der Flavonoidsynthese

Abstract

Verfärbungenin der verholzten Sprossachse von Bäumen treten zum einen konstitutiv in Form der Kernholzbildung auf, zum anderen werden sie induziert durch Verwundung und Pathogenbefall des Xylems und äußern sich in der Ausbildung von verfärbten Reaktionszonen. Diese Prozesse beruhen auf Stoffwechselleistungen des Xylemparenchyms und sind verbunden mit der Aktivierung von Enzymsystemen, die die Synthesen der farbgebenden Verbindungen katalysieren. Die Phenylalanin-Ammoniumlyase (PAL), das einleitende Enzym des Phenylpropanstoffwechsels, und die Chalkonsynthase (CHS), das einleitende Enzym der Flavonoidsynthese, nehmen bei diesen Verfärbungsprozessen eine Schlüsselposition ein. Voraussetzung dafür ist eine Umstellung des Stoffwechsels und im Zuge dessen eine Aktivierung der für die beteiligten Enzyme codierenden Gene. Am Beispiel der Robinie (Robinia pseudoacacia L.), einer Baumart mit obligater Farbkernbildung, wurde die Expression von PAL- und CHS-Genen in diesen Verfärbungszonen, sowie im übrigen (unverfärbten) Splintholz während der Vegetationsperiode untersucht. Dazu wurden die in Multigenfamilien organisierten PAL- und CHS-Gene kloniert und sequenziert und auf diese Weise vier PAL-Gene (RpPAL1, 2, 3 und 4), und sechs CHS-Gene identifiziert (RpCHS1, 2, 3, 4, 5 und 6). Diese wiesen ein hohes Maß an Sequenzkonservierung in der codierenden Region auf. Basierend auf den stärker divergierenden 3’-untranslatierten Regionen wurden genspezifische Primer (GSPs) für jeweils vier PAL- und vier CHS-Gene konstruiert. Mit Hilfe der GSPs wurde durch semiquantitative RT-PCR und durch Real-Time PCR die Expression von RpPAL1-4 und von RpCHS3-5 in den betreffenden Xylemgewebeabschnitten analysiert. Im gesunden Xylem der Robinie zeigen drei PAL- und drei CHS-Gene eine saisonale und gewebespezifische Regulation mit qualitativ ähnlichen, quantitativ jedoch unterschiedlichen Expressionsmustern. Ein PAL-Gen wird im Xylem gar nicht exprimiert (RpPAL4). Transkripte von RpPAL1, 2 und 3 weisen im Stammquerschnitt in radialer Richtung ein zweigeteiltes Verteilungsmuster auf, mit starker Expression in der Xylemdifferenzierungszone (DX) und in der Splint-Kern-Übergangszone (TZ). Dies weist auf die Beteiligung der PAL-Gene sowohl an der Lignin- als auch an der Flavonoidsynthese hin. Eine saisonale Komponente der Regulation besteht in einem Expressionshöhepunkt der drei PAL-Gene in der TZ in den Sommermonaten. Die drei untersuchten CHS-Gene RpCHS3, 4 und 5 werden strikt gewebespezifisch und mit jeweils unterschiedlichen Anteilen in der TZ exprimiert. Sie haben ihren saisonalen Expressionshöhepunkt vom Sommer bis in den Herbst. RpPAL1 und RpCHS3 erwiesen sich als die jeweils am stärksten exprimierten Mitglieder der beiden Genfamilien. Zusammenfassend betrachtet erweisen sich die Expressionsmuster der untersuchten PAL- und CHS-Gene bei der konstitutiven Kernholzbildung, sowie im übrigen gesunden Robinienstamm als qualitativ ähnlich, eine differentielle Genexpression liegt lediglich in quantitativer Hinsicht, d.h. in den anteiligen Beiträgen der Gene an der Gesamtexpression vor. Eine funktionelle Differenzierung liegt bei den betrachteten PAL- und CHS-Genfamilienmitgliedern nicht vor (Ausnahme: RpPAL4, welches im Xylem nicht exprimiert wird). Zudem wurden deutliche saisonale Schwankungen in der Expression aufgezeigt, die mit den bisherigen Erkenntnissen über die Jahresrythmik der Kernholzbildung übereinstimmen. Ferner wurde die PAL- und CHS-Genexpression in der sich bildenden Reaktionszone des Robinienstamms nach Verwundung und Infektion mit dem holzzerstörenden Basidiomyceten Phellinus robiniae untersucht (Infektionsexperiment: Busch 1999). Von den vier untersuchten PAL-Genen wurden drei in der Reaktionszone exprimiert (RpPAL1-3), wobei bereits drei Tage nach Verwundung und Infektion ein Anstieg der Transkriptgehalte im Vergleich zum gesunden äußeren Splintholz unbehandelter Bäume (Jahreszeitenkontrollen) auftrat, und welcher über den gesamten Untersuchungszeitraum von 360 Tagen erhöht blieb. Anteilsmäßig dominierte RpPAL1, wurde jedoch, bezogen auf die Expression im gesunden Xylem, nicht spezifisch induziert. RpPAL2 und 3 wurden induziert, nahmen im Vergleich zu RpPAL1 jedoch nur einen geringen Anteil an der Gesamtexpression ein. Von den drei untersuchten CHS-Genen RpCHS3, 4 und 5 wurden alle drei bereits drei Tage nach Infektion in der Reaktionszone massiv induziert. In den Jahreszeitenkontrollen wurden hingegen nur Spuren an CHS-Transkripten detektiert. Diese Hochregulierung blieb über den gesamten Untersuchungszeitraum erhalten. RpCHS5 nahm hier den höchsten Anteil an der CHS-Gesamtexpression ein. Mit den vorliegenden Expressionsmustern der PAL- und CHS-Gene wurde eine deutliche Beteiligung der untersuchten Gene an zwei unterschiedlichen Typen von Verfärbungs-prozessen im Xylem der Robinie aufgezeigt und ein weiterer Beleg für die Schlüsselfunktion von PAL und CHS an diesen ökologisch und ökonomisch wichtigen Prozessen geliefert.

Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and chalcone synthase (CHS), two key enzymes of flavonoid synthesis, play crucial roles for wood discolorations occurring during both constitutive heartwood formation and pathogen defense in sapwood of standing trees. Differential expression of PAL and CHS genes, both of which are encoded by multigene families, is thought to be of importance for regulation of enzyme activity. Three PAL and four CHS genes (RpPAL1 – 3 and RpCHS3 – 6) of the broad-leaved tree Robinia pseudoacacia L. were identified. Seasonal and tissue-specific expression of these genes was analysed by Quantitative Real-Time PCR in sound sapwood and in the sapwood-heartwood transition zone (TZ) as well as during wood discolorations occurring after wounding and infection with the wood-decay fungus Phellinus robiniae. In sound sapwood, PAL and CHS genes showed stringent seasonal and tissue-specific expression patterns, with PAL genes being strongly expressed in the TZ and the outermost sapwood regions and CHS gene expression being almost exclusively confined to the TZ. In the pathogen-induced discoloring sapwood, expression of PAL genes consisted of a constitutive and an induced component, whereas the CHS genes under examination were strongly induced. PAL and CHS gene expression differed rather quantitatively than qualitatively between constitutive (i.e. heartwood formation) and induced (i.e. reaction zone formation) types of wood discolorations.