Rekombinante Expression, Charakterisierung und Target-Eigenschaften von Inositolphosphatkinasen humanpathogener Protozoen

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Inositolphsophatkinasen [IPKs] aus den Protozoen Entamoeba histolytica [EhIPK-1] und Trichomonas vaginalis [TvIPK-1] bakteriell exprimiert, gereinigt und katalytisch aktiv enzymologisch charakterisiert. Hierbei konnte die Substratselektivität für bestimmte Inositolphosphate, der KM-Wert für ATP und der KM-Wert für das jeweils vermutete Hauptsubstrat (Ins(1,4,5)P3 bzw. InsP6) mit dem daraus abzuleitenden vmax-Wert ermittelt werden. Es wurde gezeigt, dass die EhIPK-1 nicht eindeutig einer der Gruppen bekannter Inositolphosphatkinase-Isoformen aus Metazoen zugeordnet werden kann. Es handelt sich um eine IPK, die umfangreiche IPMK-Fähigkeiten vorweisen kann und mehrere von Metazoen bekannte Substratspezifitäten vereinigt. Neben der Akzeptanz von einer Vielzahl von Inositolphosphat-Substraten, die das Enzym an freien Hydroxylgruppen phosphoryliert, ist die EhIPK-1 in der Lage, eine große Anzahl von pyrophosphorylierten Inositolphosphaten in Form von bspw. PP-InsP3-, PP-InsP4- und PP2-InsP3-Isomeren zu bilden, deren Funktion bisher noch weitgehend ungeklärt ist. Momentan können nur erste Modelle bezüglich der genauen Struktur dieser Pyrophosphate erstellt werden. Weiterführende Studien, die sich mit der Struktur der Pyrophosphate und Recognition-Sites der EhIPK-1 beschäftigen, könnten Aufschluss darüber geben. Um der Frage nachzugehen, ob die EhIPK-1 tatsächlich als Ins(1,4,5)P3-Kinase fungieren könnte, wäre es sehr interessant eine qualitative und quantitative Bestimmung der Inositolphosphate in Entameoba histolytica in vivo bspw. durch Extraktion der Inositolphosphate mit anschließenden MDD-HPLC-Analysen durchzuführen. Einerseits könnten so die für den Organismus essentiellen und prioritären Synthesewege, die von der EhIPK-1 katalysiert werden, identifiziert werden, andererseits könnten die in vivo vorhandenen Aktivitäten und die Funktionsvielfalt der Inositolphosphatkinase mit den hier dargestellten in vitro-Daten verglichen werden. Es könnte in diesem Zusammenhang auch die physiologische Konzentration von Ins(1,4,5)P3 innerhalb des Organismus geklärt werden. Neben der detaillierten Charakterisierung der enzymatischen Eigenschaften der EhIPK-1 konnte in dieser Arbeit auch ein erstes Inhibitorprofil für die Hemmung der Enzymaktivität durch niedermolekulare Substanzen in vitro aufgestellt werden. Sollte, wie dies bei Metaozoen und der Hefe anzunehmen ist, der sehr umfangreiche, durch die EhIPK-1 katalysierte Inositolphosphatmetabolismus für die Proliferation und für das Überleben von Entamoeba histolytica verantwortlich sein, könnten die identifizierten Inhibitoren (Aurintricarbonsäure, Quercetin, Gossypol und Bengalrosa) als alternative Antibiotika gegen Entamoeba histolytica-Infektionen genutzt werden. Die gefundenen IC50-Werte von ca. 2,5 – 10 µM erscheinen für eine enterale Therapie bereits durchaus brauchbar. In zukünftigen in vivo-Untersuchungen müssten dann die Permeation der Substanzen durch die Zellmembran von Entamoeba histolytica und die sich anschließenden zellulären Effekte der Inhibitoren nachgewiesen werden. Zusätzlich sollten die eventuellen Auswirkungen der Hemmstoffe auf den Menschen, d.h. potenzielle Nebenwirkungen der neuen Wirkstoffe, betrachtet werden. Parallel zur EhIPK-1 wurde eine zweite IPK aus Trichomonas vaginalis [TvIPK-1] erfolgreich exprimiert, aufgereinigt und enzymologisch untersucht. Neben ersten Untersuchungen bezüglich der Substratselektivität dieses Enzyms (es handelt sich offenbar um eine klassische IP6K) konnte auch der KM-Wert für ATP und der entsprechende vmax-Wert bestimmt werden. Durch weitere Substratselektivitätsuntersuchungen könnten die weiteren IPK-Aktivitäten der TvIPK-1 ebenso wie bei der EhIPK-1 detailliert untersucht werden. Durch weitere Charakterisierung der TvIPK-1 und damit verbundenen Inhibitorversuchen könnten auch hier potentielle Hemmstoffe des Enzyms gefunden werden. Hierfür könnten die gleichen Methoden wie bei der Untersuchung der EhIPK-1 verwendet werden.