Bedeutung der homologen Rekombination für die Reparatur eines DNA-Doppelstrangbruchs in Zellen mit einem Defekt im "nicht homologen Endjoining"

Abstract

Hinsichtlich des Erhalts der genomischen Stabilität stellt der DNA-Doppelstrangbuch (DSB) die folgenschwerste Läsion dar. Zur Reparatur dieser Läsionen stehen zwei vorrangige Mechanismen zur Verfügung: das nicht-homologe Endjoining (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR). NHEJ kann die sequenzunabhängige Ligation der Bruchenden vermitteln und gewährleistet so die strukturelle Integrität der DNA. HR ermöglicht durch Reparatursynthese die Rekonstruktion der zerstörten Sequenz. In dieser Arbeit sollte die Relevanz der HR für die Reparatur von DSBs überprüft werden, und dies sowohl für Zellen mit intaktem NHEJ (CHO-K1) als auch in solchen, bei denen dieser Hauptweg durch eine Defektmutation im Schlüsselprotein Ku80 (xrs5) beeinträchtigt ist. Zu diesem Zweck wurde ein Reparatursubstrat in das Genom der Zellen integriert, welches die Induktion eines DSB durch restriktionsendonukleolytische Spaltung seiner Sequenz erlaubt und damit die Messung der Frequenz von HR-Ereignissen zur Reparatur dieser DSB ermöglicht: Die Rekonstitution des Reportergens EGFP erfolgt dabei ausschließlich durch Genkonversion (GC) und kann durch die Fluoreszenz des Genprodukts durchflusszytometrisch nachgewiesen werden. Zur Vorbereitung der stabilen Integration des Rekombinationssubstrats wur-den geeignete Selektionsbedingungen ermittelt; Vorarbeiten der Rekombination-sexperimente umfassten den Nachweis der chromosomalen Integration des Re-kombinationssubstrats, die Ermittlung der Transfektionseffizienz sowie einer Ki-netik der enzymatischen DSB-Induktion. Die verwendeten xrs5 Zellen wurden auf die Persistenz des strahlenempfindlichen Phänotyps kontrolliert. Im Vergleich zu den CHO-K1-Zellen zeigten die NHEJ-defizienten xrs5-Zellen in den Rekombinationsexperimenten ein um den Faktor fünf gesteigerte Rate an GC-Ereignissen. Diese Ereignisse konnten eindeutig der HR zugeordnet werden, da eine Hemmung der posttranslationalen Expressionshemmung von RAD51 mittels RNAi in beiden Zelllinien eine Reduktion der GC-Frequenz um 60-70% bewirkte. Damit zeigte diese Arbeit, dass für einen DSB immer mehrere Reparaturwe-ge zur Verfügung stehen. Fehlt in einer ansonsten intakten Zelle das normaler-weise dominierende NHEJ, so sind unter den vollendeten Reparaturereignissen vermehrt HR-Ereignisse zu erwarten. Steht diese ebenfalls nicht zur Verfügung, kommt vermehrt SSA zum Zug, das in Anwesenheit der beiden anderen Repara-turwege normalerweise unterdrückt wird. Somit zeigt sich eine deutliche Hierarchie der DNA-Reparaturwege.