Untersuchung der Rolle von FLT3 Mutanten in der akuten lymphoblastischen Leukämie mit Hilfe eines in vivo Modells in Mus musculus (Linnaeus, 1758)

Abstract

Die FLT3 (FMS-like tyrosine kinase 3) Rezeptor-Tyrosinkinase beeinflusst die Differenzierung, Zellteilung und Apoptose früher hämatopetischer Zellen, die sowohl der myeloiden als auch der lymphoiden Linie angehören. Aktivierende Mutationen dieser Kinase werden häufig in Patienten mit akuten myeloiden sowie lymphoiden Leukämien gefunden. Zwei besonders häufig auftretende Mutationen des FLT3 Rezeptors sind zum einen Punktmutationen in der Kinasedomäne und zum anderen Insertionen einer internen Tandem- Duplikation in der Juxtamembrandomäne des Rezeptors. Beide Mutationen führen zu der Liganden-unabhängigen Aktivierung von den stromabwärts gelegenen Signaltransduktionswegen. Da diese FLT3 Mutationen relativ häufig in Patienten mit akuten Leukämien identifiziert werden konnten, stellt der Rezeptor ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für die Behandlung mit Inhibitoren dar. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu charakterisieren welche Signalwege in den zu analysierenden murinen FLT3-ITD Tumorzellen aktiviert sind. Für die Beantwortung dieser Frage stand ein bereits in der Arbeitsgruppe Molekulare Pathologie am Heinrich-Pette-Institut etabliertes Mausmodell zur Verfügung. Dabei wurde murines Knochenmark mit retroviralen Vektoren, die FLT3-ITD exprimieren, infiziert und in konditionierte Mäuse transplantiert. Die Analyse der erkrankten Tiere ergab, dass diese an einer akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL) erkrankt waren. Weitere Analysen zeigten, dass die leukämischen Blasten zwischen dem Pro- und Prä-B Zellstadium in ihrer Differenzierung blockiert waren. Die Untersuchung der Signaltransduktion der FLT3-ITD Tumorzellen ergab, dass der RAS/RAF/MAPK/ERK- und PI3K-Signalweg sowie STAT5 und FLT3 im Gegensatz zu vorher aus C57BL/6 Mäusen isolierten murinen Wildtyp Pro-B Zellen, konstitutiv aktiviert waren. In dieser Arbeit gelang es zum ersten Mal FLT3-ITD Tumorzellen in sekundäre Rezipienten zu transplantieren. Diese Mäuse erkrankten nach einer sehr kurzen Latenzphase ebenfalls an einer lymphoblastischen Leukämie, was die Aggressivität dieser Leukämie hervorhebt. Es gelang im Rahmen dieser Arbeit ein ex vivo System zu entwickeln, in dem FLT3-ITD Tumorzellen in semi-liquider Methylzellulose, supplementiert mit murinem Interleukin 7 (mIL7), kultiviert werden konnten. Mithilfe dieser Zellen konnten Inhibitorversuche durchgeführt werden, um die Wichtigkeit und den Einfluss der verschiedenen Signalwege auf die Proliferation und die Apoptose der FLT3-ITD Tumorzellen zu charakterisieren. Für die Versuche wurden niedermolekulare Inhibitoren oder dominant negative Formen des STAT5-Proteins (DN STAT5) eingesetzt. Es zeigte sich, dass alle Inhibitoren sowie die Expression von DN STAT5 Mutanten die Proliferation der FLT3-ITD Tumorzellen verringerte und einen Einfluss auf die Fähigkeit der Tumorzellen, Kolonien in der Methylzellulose auszubilden, hatten. Folglich konnte jeder eingesetzte Inhibitor und die DN STAT5 Mutanten einen negativen Einfluss auf die Proliferation der FLT3-ITD bewirken, was die Wichtigkeit aller aufgeführten Signalwege für die Tumorzellen unterstreicht. Bisher wurde in Mausmodellen anderer Arbeitsgruppen gezeigt, dass FLT3-ITD allein nicht in der Lage ist, eine Leukämie auszulösen. Da diese Ergebnisse im Gegensatz zu unserem Mausmodel stehen, war ein weiteres Ziel dieser Arbeit zu analysieren, ob die FLT3-ITD Expression allein ausreichend ist, um die ALL auszulösen, oder ob sekundäre Mutationen in den Tumoren vorlagen, die die Leukämogenese erhöht haben könnten. Dabei könnte es sich um Mutationen handeln, die durch die Integration des Provirus in das Mausgenom zustande gekommen sind. Es konnte gezeigt werden, dass die FLT3-ITD Tumore klonal waren und multiple Integrationsstellen besaßen. Bei vier der identifizierten Integrationsstellen handelt es sich um sogenannte CIS („common integration sites“). Diese Integrationsstellen wurden bereits von anderen Arbeitsgruppen in verschiedenen Tumoren identifiziert. Alle in dieser Arbeit charakterisierten CIS sind in den Kalziumsignalweg eingebunden. Dieser spielt unter anderem in der Signalwirkung des Prä-B Zellrezeptors eine Rolle. Da die FLT3-ITD Tumorzellen zwischen dem Pro- und Prä-B Zellstadium in ihrer Differenzierung blockiert sind, könnte dies ein Hinweis darauf sein, dass die Funktionalität des Prä-B Zell Rezeptors durch die Dysregulation des Kalzium-Signalweges, beeinträchtig wurde. Die im Zuge dieser Arbeit durchgeführten Analysen zur Signaltransduktion können zur Beantwortung der Frage beitragen, ob die Behandlung von FLT3-ITD positiven Leukämiepatienten mit niedermolekularen Kinase-Inhibitoren erfolgsversprechend ist. Durch die Charakterisierung kooperierender Mutationen können neue Strategien zur Behandlung der Leukämiepatienten entwickelt werden.