Identification of novel polysialic acid interacting partners and functional relevance of their interaction for peripheral nerve regeneration after injury in Mus musculus (Linnaeus, 1758).

Abstract

Nach traumatischer Verletzung peripherer Nerven entstehende Funktionseinbußen werden bis heute unterschätzt und die Entwicklung neuer Therapien zur Verbesserung der Regeneration und zur Unterstützung der Mikrochirurgie ist dringend notwendig. In Nagetieren konnte gezeigt werden, dass polysialyliertes NCAM nach einer Läsion in Axonen peripherer Motoneurone und in Schwann´schen Zellen heraufreguliert wird. Basierend auf diesem Befund wird angenommen, dass Polysialinsäure (PSA) durch Erhöhung der Synapsenbildung eine verbesserte präferentielle Re-Innervierung (selektive „Zielerkennung“) von Motoneuronen stimuliert. PSA ist deshalb ein interessanter Kandidat für die Medikamentenentwicklung und zum Einsatz zur Unterstützung der Reparatur von verletzten Nerven. Um die positiven Effekte des PSA Kohlenhydrats für die Therapien von peripheren Nervenverletzungen nutzbar zu machen, müssen die Bindunspartner dieses Kohlenhydrats identifiziert werden, da das Kohlenhydrat selbst nicht für therapeutische Anwendungen eingesetzt werden kann. Es wurde gezeigt, dass PSA mit Molekülen der extrazellulären Matrix, wie Heparan- Sulfat-Proteoglykanen, dem neurotrophischen Faktor BDNF und dem Hormon Estradiol, interagiert. Es konnten unter Verwendung eines PSA mimikriernden „single chain variable fragment“ (scFv) Antikörpers, der einen anti-idiotypischen Antikörper gegen einen PSA-Antikörper darstellt, Histon H1 und das myristoylierte Alanin-reiche C-Kinase Substrat (MARCKS) als neue potentielle PSA-Interaktionspartner identifiziert werden. Die Untersuchung der Lokalisation dieser Moleküle in lebenden und fixierten Zellen zeigte, dass Histon H1 und MARCKS mit PSA ko-lokalisiert vorliegen. Mittels ELISA konnte zudem eine direkte Interaktion zwischen PSA und Histon H1, aber nicht zwischen PSA und MARCKS nachgewiesen werden. Durch Oberflächenbiotinylierung von Körnerzellen aus dem Cerebellum konnte zudem nachgewiesen werden, dass Histon H1 auch extrazellulär lokalisiert vorkommt. Mit Hilfe von Immunfärbungen von Körnerzellen und von Schwann´schen Zellen ließ sich zeigen, dass extrazelluläres Histon H1 mit PSA im Extrazellularraum oder auf der Zelloberfläche ko-lokalisiert. Immunfärbung hippokampaler Neurone zeigte weiterhin, dass sowohl MARCKS als auch PSA teilweise auf der Zellmembran ko-lokalisiert vorliegen. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass extrazelluläres Histon H1 die Bildung von Fortsätzen und die Proliferation von Schwann´schen Zellen, die Neuritogenese bei Körnerzellen und die Migration neuraler Stammzellen in vitro stark fördert, und dass diese Prozesse PSA abhängig sind. Diese Resultate zeigen, dass Histon H1 in der extrazellulären Matrix neuronaler Zellen vorliegt, wo es mit PSA interagiert und für die Entwicklung des Nervensystems wichtige Prozesse wie Neuritenwachstum, Zellmigration und Proliferation reguliert. Um die Funktion von Histon H1 während der Regeneration des Nervensystems zu untersuchen, wurde der Femuralis Nerv in adulten Mäusen läsioniert, und die Regeneration in vivo untersucht. Applikation on Histon H1 verbesserte die funktionelle Regeneration, das Wiederauswachsen von Axonen und die Präzision bei der Reinnervation nach Verletzung des Femuralis Nervs. Diese Ergebnisse zeigen, dass Histon H1 eine wichtige Rolle bei der Regeneration im peripheren Nervensystem der Maus spielt. In meiner Arbeit konnte ich zeigen, dass Histon H1 in der extrazellulären Matrix von neuronalen Zellen vorkommt und dort spezifisch mit PSA interagiert um Migration neuronaler Zellen, Proliferation und Auswachsen von Neuronen zu induzieren. Diese Daten zeigen, dass der Interaktion zwischen Histon H1 und PSA während der Entwicklung und der Regeneration des Nervensystems nach Verletzung eine wichtige Funktion zukommt.

Traumatic peripheral nerve injuries are still underestimated and there is a major requirement for new therapies improving functional recovery after injury and to support microsurgery. In rodents, polysialylated NCAM (PSA-NCAM) was reported to be up-regulated in peripheral motor axons and Schwann cells after lesion. Based on this, it is hypothesized that polysialic acid (PSA) promotes preferential motor reinnervation (selective targeting) by enhancement of synapse formation. This makes PSA an interesting molecule for drug development and to support nerve repair. To make the positive effects of the PSA carbohydrate available for therapy of peripheral nerve injuries, potential binding partners of this carbohydrate have to be identified, since the carbohydrate itself is not useful for therapeutic approaches. PSA has been shown to interact with extracellular molecules like heparan sulphate proteoglycans, the neurotrophic factor BDNF and the hormone estradiol. Histone H1 and myristoylated alanine-rich C kinase substrate (MARCKS) have been identified as potential binding partners of PSA using a PSA mimicking single chain variable fragment (scFv) antibody which is an anti-idiotypic antibody against a PSA antibody. Co-localization studies on live and fixed neuronal cells demonstrated that Histone H1 and MARCKS are co-expressed with PSA, although only a direct binding between PSA and Histone H1, but not between PSA and MARCKS using ELISA could be shown. Moreover, surface biotinylation of cerebellar granule cells confirmed the extracellular localization of Histone H1. Live staining of cerebellar neurons and Schwann cells confirmed that an extracellular pool of Histone H1 co-localizes with PSA in the extracellular matrix or on the cell surface. Staining of fixed hippocampal neurons showed that both MARCKS and PSA partially co-localize at the cell membrane. Furthermore, extracellular Histone H1 strongly stimulated process formation and proliferation of Schwann cells, neuritogenesis of cerebellar neurons and migration of neural stem cells from neurospheres via a PSA dependent mechanism in vitro. These results indicate that Histone H1 is present in the extracellular matrix of neuronal cells, where it not only interacts with PSA but also regulates neurite outgrowth, cell migration and proliferation which are crucial during nervous system development. To evaluate the function of Histone H1 during regeneration of the nervous system, in vivo femoral nerve lesion experiments were performed in adult mice. Application of Histone H1 improved the functional recovery, axon regrowth and the precision of reinnervation after femoral nerve injury, indicating that Histone H1 plays a functional role during regeneration in the peripheral nervous system in mice. These results indicate that Histone H1 is present in the extracellular matrix of neural cells, where it interacts specifically with PSA and regulates neural cell migration and proliferation as well as neurite outgrowth; pointing out that the interaction between Histone H1 and PSA plays an important role during development and in regeneration of the nervous system.