Charakterisierung der zellulären Funktionen und Interaktionspartner des Yersinia enterocolitica (Schleifstein and Coleman 1939) outer protein YopO

Abstract

Das enteropathogene Bakterium Yersinia enterocolitica hat verschiedene Virulenzmechanismen entwickelt, um die Immunantwort zu modulieren, der Phagozytose zu entgehen und sich das Überleben im Extrazellularraum lymphoider Gewebe zu sichern. Über das Typ-III-Sekretionssystem schleust dieser Erreger nach dem Kontakt mit der eukaryotischen Wirtszelle sechs verschiedene Effektorproteine, die sogenannten Yersinia outer proteins (Yops), in die Zelle. Diese modulieren verschiedenste Signalwege und beeinträchtigen so antibakterielle Abwehrmechanismen, wie die Phagozytose, die Ausschüttung von Zytokinen und zelluläres Überleben durch unterschiedliche biochemische Aktivitäten. Eines dieser Effektorproteine in Y. enterocolitica ist die 729 Aminosäuren große Serin/Threonin-Kinase YopO. Neben seiner Kinase-Domäne (Aminosäuren 89-440) beinhaltet das Protein noch eine Membran-Lokalisations-Domäne (MLD, Aminosäuren 1-89) und eine C-terminale GDI-ähnliche Region (Aminosäuren 440-729). Die Translokation von YopO führt zu einer Zerstörung des Aktin-Zytoskeletts und damit zur Inhibition der Phagozytose, dabei sind die verursachenden Mechanismen und die Beteiligung der verschiedenen Domänen allerdings noch unklar. Im Rahmen dieser Arbeit konnte mit CIB1 ein Substrat für die Serin/Threonin-Kinase YopO identifiziert werden, welches in vitro an den Serinen –185 und –186 phosphoryliert wird. Mit Hilfe von Koimmunpräzipitationsversuchen konnte zum einen die Interaktion bestätigt werden und zum anderen der CIB1-YopO-Interaktionsbereich innerhalb des YopO-Moleküls identifiziert werden. Dabei ist die MLD-Domäne von YopO essentiell für die Interaktion mit CIB1. Bei der Untersuchung der Rolle der CIB1-Phosphorylierung für die Zellmorphologie mit Hilfe eines Spreading-Assays konnte allerdings kein Einfluss dieser Phosphorylierung auf die Morphologie der Zellen festgestellt werden. Für die Charakterisierung weiterer zellulärer Effekte von transloziertem YopO wurde mit Hilfe des Flp-InTM-T-RExTM-Systems eine HEK293Zelllinie etabliert, die tetracyclinabhängig das Effektorprotein YopO exprimiert. So konnte mit Hilfe von fluorimetrischen Ca2+-Messungen ein inhibitorischer Einfluss von YopO auf den zytosolischen Ca2+-Einstrom aus intrazellulären Speichern, der für verschiedenste antibakterielle Abwehrmechanismen essentiell ist, in dieser stabilen Zelllinie dargestellt werden. Luciferase-Assays zeigten außerdem in Abhängigkeit von YopO eine verminderte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB, der für die Produktion und Ausschüttung von Zytokinen, Chemokinen und Apoptoseregulatoren während der Inflammation verantwortlich ist.