Role of MET in SV40-induced mammary tumorigenesis

Abstract

Role of MET in SV-40 induced mammary tumorigenesis: Our laboratory generated and characterized a transgenic mouse model (WAP-T mice) suitable for molecular analysis of initiation and progression of mammary adenocarcinoma. Expression of SV40 early proteins in WAP-T mice is initiated during late pregnancy, and tumors develop from T-antigen expressing mammary epithelial progenitor cells that survived involution. Molecular analyses of the tumours by aCGH and gene expression profiling revealed that the MET gene is amplified and strongly expressed in nearly all undifferentiated tumors. Therefore, we focused on the role of MET during SV40-induced tumorigenesis. Double staining for MET and SV40 T-antigen (T-Ag) in an established mammary epithelial tumour cell line called G2 from our mice showed that MET expression levels were directly proportional to T-Ag expression levels, indicating a role for T-Ag in regulating MET expression. Ectopic expression of T-Ag in mouse embryo fibroblasts with wild-type p53 (wtp53) or p53-null background revealed a significant T-Ag dependent increase in MET expression in cells with wtp53 compared to p53-null background. The data suggested that MET expression is repressed by wtp53, and that this repression is alleviated by p53 inactivation through complex formation with T-Ag. To confirm the role of wtp53 in MET expression, we investigated MET expression in mouse cG9 cells which express a temperature-sensitive p53 that is wild-type at 32°C and mutant at 39°C, respectively. We observed increased expression of MET when p53 was in a mutant conformation. The data further supported the postulated p53-dependent repression of the MET gene and the action of T-Ag that leads to transcriptional inactivation of p53 by complex formation. By ChIP assay we detected binding of p53 to the MET promoter, which was abolished when T-Ag was co-expressed. Silencing of MET using shRNA in T-Ag transformed cells abrogated these cells’ ability to form colonies in soft agar, highlighting the role of MET in proliferation and substrate-independent growth. We conclude that p53 acts as a repressor of the MET gene. Alleviation of this repressor function by T-Ag is essential for T-Ag mediated cellular transformation.

Die Funktion von MET in der SV40 induzierten Brustkrebsentstehung: In unserer Arbeitsgruppe wurde ein transgenes Mausmodell (WAP-T Maus) entwickelt und charakterisiert, mit dem die Entstehung eines Brust Adenokarzinoms auf molekularer Ebene analysiert werden kann. Die Expression des Transgens, der frühen SV40 Genregion, wird am Ende der Schwangerschaft durch laktotrophe Hormone induziert. Die Tumore entwickeln sich aus T-Antigen exprimierenden Epithelzellen der Brustdrüse, die die Involution überlebt haben. Molekularbiologische Untersuchungen dieser Tumore durch aCGH und Genexpressionsanalyse deckten eine Amplifikation und verstärkte Expression des MET Gens in nahezu allen undifferenzierten Tumoren auf. Aufgrund dessen wurde die Rolle von MET in der SV40 induzierten Tumorgenese genauer analysiert. Die Immunfluoreszenz-Doppelfärbung von MET und SV40 T-Antigen (T-Ag) in einer aus unserem Mausmodell etablierten epithelialen Mammakarzinom Zelllinie (G2 Zelllinie) zeigte, dass sich die MET Expression direkt proportional zur Expression von T-Ag verhält. Dies weist auf eine Funktion von T-Ag in der Regulation der MET Expression hin. Die ektope Expression von T-Ag in Mausembryofibroblasten mit Wildtyp p53 (wtp53) oder p53-null Genotyp zeigte einen signifikanten, T-Ag abhängigen Anstieg der MET Expression in Zellen mit wtp53 im Vergleich zu p53-null Zellen. Daraus lässt sich schließen, dass die MET-Expression durch wtp53 supprimiert wird und diese Unterdrückung durch die Bildung von p53-T-Ag Komplexen revertiert wird. Um die negative Regulation der MET-Expression durch wtp53 zu bestätigen, wurde die MET-Expression in Maus cG9 Zellen untersucht. Diese Zelllinie exprimiert eine Temperatur sensitive Mutante von p53, welche bei 32°C Wildtyp-Konformation und bei 39°C Mutanten-Konformation besitzt. In Gegenwart von p53 in der Mutanten-Konformation wurde eine verstärkte Expression von MET beobachtet. Dieser Versuch bestätigte zudem die postulierte wtp53 abhängige Unterdrückung des MET Gens und die Rolle von T-Ag in der Inaktivierung von p53 durch Komplexbildung bestätigt werden. Mittels ChIP Analysen wurde eine Bindung von p53 an den MET Promotor nachgewiesen, die durch die Ko-Expression von T-Ag aufgehoben werden konnte. Die Reduktion der MET Expression durch spezifische shRNA in T-Ag transformierten Zellen hob deren Fähigkeit zur Koloniebildung in Softagar auf, was die Bedeutung von MET für Proliferation und Substrat unabhängiges Wachstum hervorhebt. Aus den vorliegenden Daten ergibt sich, dass p53 als Repressor des MET Gens fungiert. Die Aufhebung dieser Repressorfunktion durch Interaktion mit T-Ag ist entscheidend für die T-Ag vermittelte zelluläre Transformation.