Regeneration of the Optic Nerve in Danio rerio (Hamilton, 1822); Identification of Novel Genes and Analysis of the robo2 Mutant

Abstract

In contrast to mammals, zebrafish are able to regenerate their central nervous system (CNS).In this thesis we focused on zebrafish and its optic projection, being part of the CNS, to shed new light on details of regeneration hitherto unknown. Two approaches addressing different aspects of CNS regeneration were chosen as research topics. Both topics deal with genes important during regeneration, the first using an in vitro approach the second is based on in vivo experiments and observations. The first topic deals with the identification of novel genes which are associated with optic axon regeneration. The second topic is the analysis of pathfinding in regenerating optic axons of adult zebrafish. Identification of novel genes was performed with zebrafish Affymetrix® microarray chips. From the regulated genes we picked the CRMP (collapsin response mediator protein) family for further analysis. CRMPs are cytosolic phosphoproteins, playing important roles in microtubuli assembly and signal transduction. Employing the technique of in situ hybridization we tested 6 CRMP family members (CRMP-1 to -5b) for their expression in the developing eye, in the unlesioned adult eye and in the adult eye 11 days after an optic nerve lesion. CRMP-2, -4 and -5a show expression in the retinal ganglion cell (RGC) layer both during development and after lesion and thus show a recapitulation of developmental expression in regeneration. In contrast, CRMP-3 is only expressed in the RGC layer after a lesion, whereas CRMP-5b exhibits expression only during development. Summarizing, CRMP-2, -3, -4 and –5a are upregulated in zebrafish after a lesion and thus seem to be good candidates for further research in the regeneration of the CNS in mammals. Regenerating optic axons in zebrafish have to make many pathfinding decisions in order to reestablish a correct projection and topography. To gain more insight into pathfinding during regeneration of optic axons, a known developmentally active pathfinding gene, robo2, was chosen for observations. The astray mutant, carrying a null-mutation of the robo2 gene, opened up the possibility to test whether robo2 is needed for correct pathfinding decisions during adult regeneration of the optic projection. The adult optic projection of the astray mutant before and after regeneration was morphologically described in detail for the first time. Rostro-caudal pathfinding errors and ectopic midline crossings occur significantly less frequently in astray mutants with a regenerated optic projection than in unlesioned adult astray mutants. On the other hand irregular growth into the tectum and termination errors in the pretectum and tectum are repeated during regeneration of the optic projection in astray mutants. Summarizing, our results show that pathfinding of regenerating optic axons in part depends on robo2 function. Additionally, our results seem to suggest, that ectopic tracts were not re-innervated during regeneration of the optic projection. This seems to indicate, that degenerating tracts do not strongly influence the path of regenerating optic axons in the astray mutant. Looking at the mammalian CNS, the insufficiency of presenting only growthpromoting glial cells to non-regenerating mammalian CNS axons in order to gain directed growth becomes clear. Thus, navigational cues in CNS regeneration might turn out to be of utmost importance for mammals as demonstrated here for zebrafish.

Im Vergleich zu Säugetieren können Zebrafische ihr zentrales Nervensystem (ZNS)regenerieren. In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf den Zebrafisch und seine optische Projektion, Bestandteil des ZNS, um bisher unbekannte Einzelheiten der Regeneration zu untersuchen. Die ZNS-Regeneration wurde in dieser Arbeit von zwei unterschiedlichen Blickwinkeln, in vitro und in vivo, beleuchtet, die sich mit für die Regeneration wichtigen Genen beschäftigt. Der erste beschäftigt sich mit der Identifizierung von bisher unbekannten Regenerations-assoziierten Genen, der zweite mit dem Wegfindungsphänomen regenerierender optischer Axone im adulten Zebrafisch. Neue Gene wurden mit Hilfe von spezifischen Zebrafisch Affymetrix® microarray chips identifiziert. Die CRMP (collapsin response mediator protein) Familie wurde aus der Gruppe der regulierten Genen ausgewählt, die zur Gruppe der cytosolischen Phosphoproteine gehören und eine wichtige Rolle beim Zusammenbau von Microtubuli und in der Signaltransduktion spielen. Mit Hilfe der in situ Hybridisierung untersuchten wir 6 Mitglieder der CRMP Familie (CRMP-1 bis -5b) auf ihre Expression im sich entwickelnden Auge, im ausgewachsenen nicht-lädierten und dem lädierten Auge (11 Tage nach Läsion). CRMP-2, -4 und -5a werden in der Retina Ganglien Zellschicht (RGZ) sowohl während der Entwicklung als auch nach Läsion des adulten optischen Nervs exprimiert und weisen eine Rekapitulation der in der Entwicklung exprimierten Gene in der Regenerationsphase auf. Andererseits wird CRMP-3 nur nach einer Läsion in der RGZ-Schicht exprimiert, während CRMP-5b ausschliesslich im sich entwickelnden Auge exprimiert wird. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass CRMP-2, -3, -4 und 5a nach einer Läsion im Zebrafisch hochreguliert sind und sich daher als Kandidaten für weitere Forschungen im Feld der ZNS Regeneration bei Säugetieren anbieten. Regenerierende optische Axone im Zebrafisch müssen zahlreiche Wegfindungsentscheidungen treffen, um eine korrekte Projektion und Topographie wieder zu erstellen. Um einen tieferen Einblick in die Wegfindungsmechanismen während der Regeneration optischer Axone zu gewinnen, wurde ein bekanntes, in der Entwicklung aktives Wegfindungs-Gen, robo2, für unsere Untersuchungen gewählt. Die astray-Mutante, welche eine Null-Mutation für das robo2 Gen trägt, ermöglichte die Beantwortung der Frage, ob robo2 während der adulten optischen Regeneration an korrekten Wegfindungsentscheidungen beteiligt ist. In diesem Zusammenhang wurde die optische Projektion der astray-Mutante vor und nach der Regeneration zum ersten Mal morphologisch detailliert beschrieben. Rostro-kaudale Wegfindungsfehler und ektopisches Kreuzen der Mittellinie traten mit signifikant verringerter Häufigkeit in astray-Mutanten mit regenerierter optischer Projektion auf. Andereseits wiederholen sich während der Regeneration der optischen Projektion der astray-Mutanten Fehler des Einwachsens in das Tectum und Terminationsfehler im Prätectum und Tectum. Zusammenfassend zeigen unsere Resultate, daß robo2 teilweise verantwortlich für die korrekte Wegfindung regenerierender optischer Axone ist. Zusätzlich lassen die Ergebnisse vermuten, daß ektopische Trakte nicht reinnerviert wurden. Dies kann als Hinweis darauf gewertet werden, daß degenerierende Trakte keinen starken Einfluß auf die Wegfindung regenerierender optischer Axone in der astray-Mutante haben. Betrachtet man in diesem Zusammenhang das ZNS der Säuger, wird offensichtlich, dass wachstumsfördernde Gliazellen, die man mit nicht regenerierenden ZNS Axonen der Säuger zusammenbringt nicht ausreichend sind, um zielgerichtetes Wachstum zu induzieren. So könnten auch für die ZNS Regeneration in Säugern Navigationshilfen, wie in dieser Arbeit für den Zebrafish gezeigt, äußerst wichtig sein.