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dc.contributor.advisorWagener, Christoph (Prof. Dr.)
dc.contributor.authorSeyed Mortezai, Naghmeh
dc.date.accessioned2020-10-19T12:46:29Z-
dc.date.available2020-10-19T12:46:29Z-
dc.date.issued2010
dc.identifier.urihttps://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/3747-
dc.description.abstractDas Ziel der vorliegenden Dissertation war die  Entwicklung eines empfindlichen Verfahrens, das es  ermöglichen soll, gering konzentrierte diagnostisch  relevante Glykoproteine in humanem Plasma zu identifizieren, ohne dass deren Identität im Vorhinein bekannt ist.  Hierfür wurden zwei affinitätschromatographische Schritte  miteinander kombiniert. Zunächst wurde eine Anreicherung  der im Plasma vorhandenen Glykoproteine aus einem Pool  gesunder Kontrollpersonen über eine Wheat Germ Agglutinin  (WGA) Affinitäts Chromatographie vorgenommen.  Durch die Lektinfraktionierung des humanen Plasmas konnten  ca. 96 % der gesamten Plasmaproteinmenge abgetrennt werden.  Um die Analyse gering konzentrierter Plasmaproteine in der WGA gebundenen Fraktion zu ermöglichen, war eine selektive Abtrennung  von regulär vorkommenden Proteinen der Glykoproteinfraktion  erforderlich. Die WGA gebundene Plasmaproteinfraktion Gesunder wurde für die  Immunisierung eines Lamas eingesetzt, um hochspezifische  Antikörper gegen die Glykoproteine des Normalplasmas zu  erhalten. Cameliden (Kamele und Lamas) bilden neben  konventionellen Antikörpern eine besondere Form von  Antikörpern, bei denen die leichte Kette und die  CH1 Domäne deletiert sind. Diese sogenannten  Schwerketten Antikörper besitzen im Vergleich zu konventionellen  Antikörpern eine höhere chemische und thermische Stabilität. Durch die gerichtete Immobilisierung der Schwerketten Antikörper an eine Hydrazidmatrix wurde ein Immunabsorbens mit hoher Stabilität hergestellt,  das bis zu 98 % der WGA gebundenen Plasmaproteine binden  konnte. Da die Cameliden Antikörper nur gegen Glykoproteine gerichtet sind, die  in Normalplasma vorkommen, sollten Proteine, die die  WGA gebundene Proteinfraktion aus Normalplasma nicht enthält,  nicht gebunden werden. Um diese Hypothese zu überprüfen,  wurde ein glykosyliertes Testprotein eingesetzt, das  Carcinoembryonale Antigen (CEA), das im Plasma Gesunder  nur in sehr geringen Mengen vorkommt, dessen  Plasmakonzentration jedoch beim Kolonkarzinom stark erhöht ist.  Ein Plasmapool aus gesunden Kontrollpersonen wurde mit CEA (20 pmol/ml) versetzt, die WGA gebundene Glykoproteinfraktion isoliert und eine  Abreicherung der Proteine  des Normalplasmas mit der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Matrix aus immobilisierten Cameliden-Schwerketten-Antikörpern durchgeführt. Hierbei wurde das CEA nicht  signifikant vom Immunabsorbens gebunden. Im Durchlauf der  Immun Affinitäts Chromatographie konnte das CEA mittels einer LC MSE Analyse detektiert werden. Anschließend wurden die  WGA gebundenen Plasmaproteinfraktionen von zwei  Kolonkarzinompatienten über das Immunabsorbens  aufgearbeitet. Auch in diesem Fall konnte das CEA im  Durchlauf der Affinitäts Säule angereichert und mittels  der LC MSE Analyse detektiert werden.  Durch den Einsatz derartiger Affinitäts Säulen eröffnet sich daher die Möglichkeit, durch die  Abreicherung der im Plasma Gesunder regulär vorkommender  Glykoproteine eine entsprechende Anreicherung von  diagnostich relevanten gering konzentrierten  Markerproteinen zu erreichen. In jedem Fall muss das  diagnostisch relevante Glykoprotein Glykanreste tragen,  die eine spezifische Bindung zum Lektin erlauben und  in der angereicherten Glykoproteinfraktion mit einer  Konzentration grösser 20 pmol/ml vorkommen.de
dc.description.abstractThe identification and quantification of characteristic changes in the plasma proteome can potentially be helpful in early diagnosis of a disease and monitoring of a therapy. Due to the enormous complexity and the biological heterogeneity of the human plasma proteome, the discovery of biomarkers in the low concentration range of plasma requires the depletion of highly abundant proteins. Therefore, for the detection of minor components fractionation is always required. Here we report on a tandem affinity strategy for the identification of low abundant glycosylated protein biomarkers of human plasma: In the first step we isolated a glycosubproteome of the human plasma by wheat germ agglutinin (WGA) lectin affinity chromatography. In the second step, the proteins of this subproteome were used to raise antibodies in llama (Lama glama). The heavy chain fraction of the llama antibodies was used to deplete from the WGA lectin binding fraction all proteins normally found in human plasma. In this way we selectively enriched proteins specific for a pathological state. As a proof of concept we applied this method to the analysis of plasma samples from colon cancer patients. We could demonstrate the selective enrichment of the cancer marker CEA by a factor of 600-800. For the identification and label-free quantification of the proteins isolated by this strategy electrospray QTOF LC/MS mass spectrometry was applied, using the data-independent MSE technique.en
dc.language.isodede
dc.publisherStaats- und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky
dc.rightshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2
dc.subjectCarcinoembryonales Antigende
dc.subject.ddc540 Chemie
dc.titleIdentifizierung gering konzentrierter diagnostischer Glykoproteine in humanem Plasma mittels Affinitäts-Chromatographie und Massenspektrometrie de
dc.title.alternativeTandem Affinity Depletion: A combination of affinity fractionation and immunoaffinity depletion allows the detection of low-abundance components in the complex proteomes of body fluidsen
dc.typedoctoralThesis
dcterms.dateAccepted2009-12-04
dc.rights.ccNo license
dc.rights.rshttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
dc.subject.bcl35.26 Massenspektrometrie
dc.subject.bcl35.29 Chromatographische Analyse, Elektrophorese
dc.subject.gndGlykosylierung
dc.subject.gndGlykoproteine
dc.subject.gndBiomarker
dc.subject.gndMassenspektrometrie
dc.subject.gndLC-MS
dc.subject.gndAntikörper
dc.subject.gndLectine
dc.subject.gndBlutplasma
dc.subject.gndChromatographie
dc.type.casraiDissertation-
dc.type.dinidoctoralThesis-
dc.type.driverdoctoralThesis-
dc.type.statusinfo:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.thesisdoctoralThesis
tuhh.opus.id4759
tuhh.opus.datecreation2010-09-09
tuhh.type.opusDissertation-
thesis.grantor.departmentBiologie
thesis.grantor.placeHamburg
thesis.grantor.universityOrInstitutionUniversität Hamburg
dcterms.DCMITypeText-
tuhh.gvk.ppn642388849
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:18-47597
item.languageiso639-1other-
item.creatorOrcidSeyed Mortezai, Naghmeh-
item.grantfulltextopen-
item.creatorGNDSeyed Mortezai, Naghmeh-
item.advisorGNDWagener, Christoph (Prof. Dr.)-
item.fulltextWith Fulltext-
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen
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