Differenzierung Telomerase-immortalisierter humaner Hepatozyten mittels ektoper Expression von HNF4alpha

Abstract

Telomerase-immortalisierte humane fetale Hepatozyten lassen sich im Gegensatz zu primären Hepatozyten unbegrenzt in Zellkultur expandieren, zeigen aber im Rahmen der gesteigerten Proliferation erwartungsgemäß einen wenig differenzierten Phänotyp. Wir haben daher untersucht, inwieweit die ektope Expression des Transkriptionsfaktors HNF4alpha in diesen Zellen leberspezifische Funktionen in Zellkultur induziert. Nach stabiler Transfektion der immortalisierten Zellen mit einem HNF4alpha-Konstrukt (pcDNA3.1-HNF4alpha) oder einem leeren Kontrollvektor, wurde mittels Realtime RT-PCR und der Delta-Delta-Ct-Methode eine Überexpression von HNF4alpha nachgewiesen. Bestätigend fand sich auch eine Zunahme der Bandenintensität von HNF4alpha im Immunoblot. Konsekutiv wurden Zielgene von HNF4alpha, insbesondere Transferrin und α1-Antitrypsin, untersucht. Im Vergleich zu Kontrollzellen zeigten HNF4alpha-transfizierte Zellen einen signifikanten Anstieg von alpha1-Antitrypsin und Transferrin. Des Weiteren wurde in einem zwölftägigen Wachstumsassay (CellTiter 96) die Proliferation von HNF4alpha-transfizierten Zellen mit Kontrollzellen verglichen. HNF4alpha-transfizierte Zellen zeigten eine verminderte Proliferation mit Abnahme der Wachstumsgeschwindigkeit im Verlauf. Eine Microarray Analyse konnte eine Überexpression von HNF4alpha, das Expressionsprofil eines differenzierteren Zellcharakters sowie einer Proliferationshemmung erkennen lassen. Die gewonnenen Ergebnisse lassen darauf schließen, dass eine Überexpression von HNF4alpha in den immortalisierten Zellen trotz hoher Telomeraseaktivität eine leberspezifische Differenzierung in Zellkultur auslöst. Inwiefern die Überexpression von HNF4alpha auch die intrahepatische Reifung der Zellen begünstigt und eine Aktivierung von nicht direkt durch HNF4alpha regulierte Gene, wie z. B. für das Albumin, unterstützt, wird im Mausmodell untersucht werden müssen. Zusammenfassend bestätigen unsere Daten, dass eine leberspezifische Differenzierung von Telomerase-immortalisierten humanen Leberzellen möglich ist.