Rolle und Funktion Parasitenspezifischer Gene im Lebenszyklus von Leishmania spp.

Abstract

Die Leishmaniase ist eine weltweit verbreitete Infektionskrankheit, die durch protozoische Parasiten der Gattung Leishmania verursacht wird. Je nach infizierender Spezies werden verschiedene Krankheitsbilder unterschieden, die von selbstheilender, kutaner Leishmaniase bis hin zur lebensbedrohenden, viszeralen Leishmaniase reichen. Derzeit gibt es keine Impfstoffe gegen die Erreger und die Chemotherapie beruht häufig noch auf antiquierten und toxischen Antimon-haltigen Wirkstoffen. Eine erfolgreiche Therapie mit den wenigen vorhandenen Medikamenten wird immer mehr durch die zunehmende Resistenzentwicklung der Parasiten beeinträchtigt. Daher ist die Identifizierung geeigneter Zielstrukturen erforderlich, um neue Anti-Leishmania-Wirkstoffe zu entwickeln. Mit der forward genetics Methode des functional cloning lassen sich bislang unbekannte Gene aufgrund ihrer Funktion identifizieren. Bei diesem ergebnisoffenen Ansatz muss nichts über die Eigenschaften der Gene bekannt sein. Somit können auch solche Gene in einen funktionellen Zusammenhang gebracht werden, die nicht zu den "üblichen Verdächtigen" gehören. Im Gegensatz dazu steht der reverse genetics Ansatz der vergleichenden Genomanalyse. Hierbei werden Proteine aufgrund ihrer vermuteten Funktion und Analogie zu anderen Spezies ausgewählt. Eine anschließende Untersuchung der Kandidatengene muss dann Aufschluss über deren tatsächliche Funktion und Bedeutung bringen. Beide Strategien zur Identifizierung putativer Zielstrukturen sollten in dieser Dissertation verfolgt werden. In einem vorangegangenen Promotionsprojekt wurde durch die Verwendung des avirulenten L. major Stammes, L. major hsp100-/-, eine genomische DNA Bank nach Genen durchsucht, die die Virulenz des Stammes wieder herstellen (Reiling, 2005, Reiling et al., 2010). Tatsächlich kristallisierte sich in dieser Komplementationsanalyse ein Gen heraus, das für die Wiederherstellung der Virulenz verantwortlich zu sein schien. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte das durch functional cloning vorläufig identifizierte P46 Gen als allgemeiner Virulenzfaktor bestätigt werden. Dabei konnte zum ersten mal ein L. major spezifischer Virulenzfaktor identifiziert werden, der nicht nur in der Lage ist, das Fehlen eines Gens zu kompensieren, sondern darüber hinaus auch die Virulenz des Wildtyps erhöht. In den in vitro Makrophageninfektionen zeigte sich eine verstärkte Parasitenlast nach Infektion mit P46-überexprimierenden Parasiten. Die zeitgleiche Lokalisation des Proteins im Zytoplasma der Makrophagen deutet auf eine schützende Funktion gegen Effektormechanismen der adaptiven Immunantwort hin. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit machen deutlich, dass bereits eine geringe Veränderung der Genexpression in L. major den Ausgang einer Infektion unabhängig von der genetischen Prädisposition des Wirtes beeinflussen kann. Durch vergleichende Genomanalyse waren im Genom von Leishmania spp. bereits 2002 homologe Gene zum bakteriellen HslVU Komplex identifiziert worden. Da diese Gene nicht im menschlichen Genom vorkommen, könnten sie vielversprechende Zielstrukturen in Leishmanien darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die als HslV und HslU annotierten Gene aus L. donovani zwar in Leishmanien existieren, allerdings nicht in einem gemeinsamen Komplex vorliegen, wie dies für andere Organismen postuliert wird (Kang et al., 2001, Rohrwild et al., 1996). Mit Hilfe einer Komplementationsanalyse in E. coli HslVU-Deletionsmutanten konnte darüber hinaus eine funktionelle Homologie zu ihren bakteriellen Gegenstücken ausgeschlossen werden. Dennoch zeigten die Experimente zur Generierung von Nullmutanten, dass zwei der Gene, HslV und HslU1, essenziell für die Lebensfähigkeit von L. donovani sind, und somit vielversprechende Zielstrukturen für Anti-Leishmania Wirkstoffe darstellen.

Protozoan parasites of the genus Leishmania are the causative agents of leishmaniasis. Disease manifestations range from self-healing cutaneous lesions caused by L. major or L. mexicana, to severe muco-cutaneous lesions caused by L. braziliensis, and to potentially fatal visceral infections caused by the L. donovani complex. At present, there are no vaccines against leishmaniasis and chemotherapy relies mainly on antiquated antimony compounds. Current treatments are toxic, expensive, and losing their effectiveness due to spreading resistance. Therefore the identification of novel drug targets is necessary to establish new anti-Leishmania substances. Using forward genetics such as functional cloning enables the implication of genes in certain processes based on their function. The approach is unbiased and allows for the identification of previously unsuspected genes, thereby adding to the knowledge base. The opposite approach is reverse genetics and involves database mining. Proteins are chosen for their suspected function by analogy to their homologues in other species. The selected proteins have to be examined for their actual function. Both strategies were used in this thesis. A previous PhD project focussed on the screening of a genomic DNA cosmid library for genes that can compensate the loss of Hsp100 in the avirulent L. major hsp100-/- and restores virulence to this mutant. This complementation analysis pointed at a gene as being responsible for the restoration of virulence. Within this work, the tentatively identified P46 gene could be confirmed as a general virulence factor. This is the first Leishmania virulence factor that not only compensates the loss of a gene, but can also increase the virulence of the wild type. Additionally, in vitro macrophage infections using P46 overexpressing parasites also resulted in an increased parasite burden. Localization studies revealed P46 inside the macrophage cytoplasm, indicating a possible interaction with the host cell. This may be the mechanism of the protective role of P46 against effector mechanisms of the macrophages. The results show that even minor fluctuations of gene expression in L. major may alter the outcome of an infection, regardless of the host´s genetic predisposition. In 2002, homologues of the bacterial HslVU complex were identified in the genome of Leishmania spp. by database mining. Since these genes do not exist in the human genome or any other mammalian genome, they represent promising drug targets. This study showed that HslV and HslU exist in L. donovani but do not form a common complex as postulated for other organisms. As complementation analysis in E. coli HslVU knock-out mutants ruled out a functional homology to their bacterial counterparts. Moreover, gene replacement mutagenesis experiments revealed that the genes HslV and HslU1 are essential for the parasites´ viability and are therefore promising drug targets.