Design and synthesis of a specific inhibitor for the microtubule affinity regulating kinase (MARK)

Abstract

Die genauen Ursachen, die das Absterben von Neuronen im Verlauf der Alzheimer- Erkrankung bewirken, sind immer noch nicht vollständig aufgeklärt. Von entscheidender Bedeutung ist die Tatsache, dass die Hyperphosphorylierung von Tau zum Zusammenbruch des axonalen Transports führt. Dies ist das letzte Glied in der Kette der größtenteils unbekannten Ursachen, an deren Ende das Absterben von Neuronen steht. Der entscheidende Punkt, der dazu führt, dass der Phosphorylierungsgrad von Tau nicht mehr innerhalb der benötigten Parameter reguliert wird, ist die unnatürlich hohe Aktivität der microtubule affinity regulating kinase (MARK). Gelänge es, diese gesteigerte Aktivität zu regulieren, ließe sich der axonale Transport in den Neuronen stabilisieren. Ein spezifischer MARK-Inhibitor wäre dazu in der Lage, die Entstehung des neuronalen Zerfalls zu verlangsamen und könnte den Ausgangspunkt für eine neue Klasse von Medikamenten darstellen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, welche der aus der Literatur bekannten bekannten Zielsequenzen von MARK am stärksten an die Kinase binden. Die im Rahmen der SPR-Experimente erhaltenen Daten zeigten Bindungskonstanten zwischen 1.37 (1, KSR1, 387 LLRTESV393 ) und 3.09 mM (3, PTPH1, 387 LLRTESV393 ). Die kinetische Auswertung lieferte deutlich niedrigere KD-Werte zwischen 0.013 (4, repeat 1, 257 KSKIGST263 ) und 0.057 mM (2, Cdc25C, 211 LYRSPSM217 ). Große Differenzen in der Affinität konnten in der Untersuchung der vier repeat-Regionen des Tauproteins festgestellt werden. Die Verlängerung der ursprünglichen Sequenz um drei Aminosäuren am N-Terminus bewirkte bei den auf dem ersten und vierten repeat beruhenden Peptiden 8 (repeat 1, 254 KNVKSKIGST263 ) und 11 (repeat 4, 348 DRVQSKIGSL357 ) eine Affinitätssteigerung von 2.06 (4, repeat 1, 257 KSKIGST263 ) bzw. 1.47 mM (5, repeat 2, 288 KSKCGST294 ) auf einen KD-Wert von 0.14 (8, repeat 1, 254 KNVKSKIGST263 ) bzw. 0.29 mM (11, repeat 4, 348 DRVQSKIGSL357 ). Die beiden inneren repeats (9, 10) zeigten keine entsprechende Wirkung der weiteren Aminosäuren. Zusätzlich wurde der Effekt der Phosphorylierung auf die Bindungseigenschaften untersucht. Die zu 4 (repeat 1, 257 KSKIGST263 ) und 5 (repeat 2, 288 KSKCGST294 ) analogen phosphorylierten Peptide 6 (repeat 1, 257 KSKIG-S(PO4)-T263 ) und 7 (repeat 2 , 288 KSKCG-S(PO4)-T294 ) zeigten eine deutliche Verringerung der Affinität um Faktor 2 (6, repeat 1, 257 KSKIG-S(PO4)-T263 ) bzw. 1.5 (7, repeat 2, 288 KSKCG-S(PO4)-T294 ). Dies beweist, dass die Zielsequenzen der Kinase nach erfolgter Umsetzung zum Produkt leicht durch neues Substrat verdrängt werden können. Die Röntgenkristallstrukturen von MARK zeigen inaktive Konformationen des Proteins. Während der Kristallisierung dimerisieren je zwei Kinasen über den regulatorischen loop miteinander, wodurch dieser die Kavität versperrt. Aus dem Vergleich der Strukturen 2HAK und 1Y8G ging hervor, dass die Aminosäuren Lys 190 bis Pro214 den Hauptteil der regulatorischen Schleife ausmachen, da sie so flexibel waren, dass sie in 1Y8G nicht aufgelöst werden konnten. Die Struktur ohne den flexiblen Bereich wurde verwendet, um ATP und ein Peptid nacheinander in die Kavität zu docken. Zuvor wurde die Nukleotidbindungstasche mit Hilfe der SYBYL-Routine siteID find pockets identifiziert, wobei Strukturen anderer Kinasen als Referenz verwendet wurden. Die resultierende Geometrie zeigte eindeutig den Bereich, in dem die fehlenden Aminosäuren des loops im Inneren der Kavität verlaufen mussten. Diese wurden anschließend manuell in das Protein eingeführt. Auf diese Art und Weise wurden drei Modelle kreiert, die sich in erster Linie im Verlauf der Schleife außerhalb der Kavität unterschieden. Sie spiegeln wieder, wie sich der loop beim Herausfalten aus dem Protein bewegen könnte. Im Inneren der Bindungstasche waren die Unterschiede zwischen den Modellen noch gering. In der Peripherie, wo kaum Wechselwirkungen zwischen Protein und dem wachsenden loop gegeben waren, zeigten die Modelle in zunehmendem Maß energetische Unterschiede zu den nativen Vergleichsstrukturen. Der grundsätzliche Verlauf der modellierten loops deckte sich mit denen verschiedener nativer Kristallstrukturen. Daher konnte davon ausgegangen werden, dass die Modelle ein gutes Abbild der aktiven Konformation von MARK wiedergaben. Die auf diese Weise erarbeitete Geometrie der binding site wurde genutzt, um im Modell verschiedene linker zwischen den gebundenen Substraten zu etablieren. Diese überbrückten den Abstand zwischen dem backbone des gebundenen Peptids und dem N9 des Adenins unter Berücksichtigung der ermittelten Geometrie. Aus den anschließenden Synthesearbeiten resultierten zwei Aminosäureanaloga (17 und 23), die erfolgreich in der Festphasensynthese eingesetzt wurden. Die Peptide wurden mit einer Länge von 13 Aminosäuren synthetisiert, wobei sich die mit der modifizierten Aminosäure an Position acht befand. Diese Wahl wurde vor dem Hintergrund getroffen, dass die Peptide dazu in der Lage sein sollten, den vollständigen frontalen Bereich der Kinase abzudecken. Die Ergebnisse der SPR-Studien zeigten, dass die meisten Verbindungen keine nennenswerte Affinität zur Kinase aufwiesen. Die Peptide 55 (repeat 1, 255 NVKSKIG-23-TENLK267 ), 63 (Palladin, 505 LLNKRRG-17-VPILR517 ) und 64 (Palladin, 505 LLNKRRG-23-VPILR517 ) dagegen zeigten gute Bindungseigenschaften. Neben der SPR-Analyse wurde ein Kinase-Assay angewendet, um die Wirkung der Substanzen in vitro zu charakterisieren. Die Resultate deckten sich nur teilweise mit denen der SPR- Versuche. 63 (Palladin, 17) und 66 (Cdc25C V1, 209 SGLYRSP-23-FPENL221 ) zeigten mit einer Inhibitionsrate von rund 30 % den stärksten Effekt auf den Umsatz von MARK. Allerdings wurde für das zu 63 (Palladin, 17) analoge 64 (Palladin, 23), welches in den SPR- Experimenten eine stärkere Affinität zu MARK als 63 (63: 350 bzw. 64: 230 µM) gezeigt hat, keinerlei Effekt festgestellt. Das in vitro sehr effiziente 66 (Cdc25C V1, 23) wiederum zeigte im Biacore keine Affinität zu MARK. Diese Substanzen wurden zusätzlich einem FRET-Assay unterzogen, deren Substrat eine photometrische Verfolgung der Reaktion erlaubte. Die im ersten Test sehr effizienten Inhibitoren 63 (Palladin, 17) und 66 (Cdc25C V1, 23) zeigten hier mit KD-Werte von 49 (66) bzw. 340 µM (63) schlechtere Affinität als die anderen Peptide, deren Werte alle zwischen 4.9 (64) und 9.4 (60) µM lagen. Allerdings wurde in diesem Assay auch für 60 (KSR1, 385 ARLRRTE-17-VPSDI 397 ), welches aufgrund seiner geringen Affinität im SPR-Test als Negativkontrolle gewählt wurde, ein KD-Wert von 9.42 µM ermittelt. Die drei unterschiedlichen Testverfahren lieferten keine übereinstimmenden Ergebnisse. Während im SPR-Experiment ein System im stetigen Fluss und mit einem anderen Puffersystem verwendet wurde, war der einzige Unterschied in den Kinase-Assays das zu phosphorylierende Substrat. Fest steht, dass die synthetisierten Substanzen durchaus inhibitorisches Potential aufwiesen, wobei die Ergebnisse je nach Testmethode zum Teil deutliche Abweichungen zeigten. In allen Tests schienen die auf dem Protein Palladin beruhenden Peptide besonders effiziente Binder zu sein, auch wenn sie im FRET-Assay ähnliche Werte lieferten, wie die anderen Substanzen. Um zusätzliche Daten in Bezug auf die Spezifität der inhibitorisch wirksamen Peptide zu erhalten, wurde ein weiterer auf radioaktiv dotiertem ATP basierender Assay durchgeführt. Als Vergleichskinase fiel die Wahl auf GSK3β, welche wie MARK ebenfalls Tau phosphoryliert, allerdings an anderen Positionen. Der Vergleich der Aktivitätsverringerungen der Kinasen zeigte, dass alle getesteten Substanzen einen stärkeren Effekt bei GSK3β zeigten als bei MARK. Zusammenfassend konnten das Design und die Synthese eines inhibitorisch wirksamen Moleküls erfolgreich umgesetzt werden. Insbesondere die auf dem Protein Palladin beruhenden Peptide zeigten hohe Affinitäten im SPR-Experiment und bis zu 30 % Verringerung der Kinaseaktivität bei der Übertragung von radioaktivem Phosphat auf das Peptidsubstrat TR1 ( 255 NVKSKIGSTENLK267 ). Allerdings schwanken die Ergebnisse bei verschiedenen Assays zum Teil recht stark. Jedoch zeigte der Vergleich von MARK und GSK3β dass die erhoffte Spezifität der Konstrukte nicht im gewünschten Maß realisiert werden konnte. Zwar bewirken unterschiedliche Aminosäuresequenzen unterschiedliche Inhibitionsraten bei beiden Kinasen, jedoch konnte keine MARK-spezifische Wirkung festgestellt werden.

The molecular cause which leads to the clinical picture called Alzheimer is in most instances unknown. One final incident of this chain of events is the collapse of axonal transport. The crucial point here is that hyperphosphorylation of tau causes the development of neurofibrillary tangles and as consequence the microtubuli loose their stability. The critical shortage of essential substances in the synapse causes a complete breakdown of the cell. The event that leads to the tangles is the high degree of phosphorylation caused by an overactive microtubule affinity regulating kinase (MARK). A specific inhibitor against MARK that downregulates the hyperactivity would be able to stabilize axonal transport in neurons. This could lead to a new class of drug for the treatment of Alzheimer’s disease. The first part of this work deals with SPR-experiments which should reveal the optimal sequence for MARK to bind. The peptides were based on different targets of MARK and showed binding constants between 1.37 (1, KSR1) and 3.09 mM (3, PTPH1). The analysis of the data by their kinetics revealed constants between 0.013 (4, repeat 1) and 0.057 mM (2, Cdc25C). A closer look at the repeats showed that the outer repeats benefit from an N- terminal elongation of three amino acids while this effect is near zero concerning the inner ones (9, 10). The first and the fourth repeat showed affinities of 0.14 (8, repeat 1) and 0.29 mM (11, repeat 4). To have a closer look at the effect of phosphorylation two phosphopeptides have been synthesized. The phosporylated analogues of 4 (repeat 1) and 5 (repeat 2; 6 and 7) showed a twofold decrease in affinity. This proofs that the products are easyly replaced by new educts. Every available crystal structures of MARK showed inactive conformations. During the event of chrystallisation the kinases dimerized with the regulatory loop as main dimerization area. This event positions the loop in front of the cavity and therefore no substrate can enter the active site. A comparison between the structures 2HAK and 1Y8G revealed that the amino acids Lys 190 to Pro214 were the main part of the regulatory loop. In the structure 1Y8G they were so flexible that their positions could not be extrapolated from the crystallographic data. The structure whithout the loop was used to dock nucleotide and peptide one after the other into the cavity after the nucleotide binding site has been enlightened by the routine siteID find pockets using other kinase-structures for comparison. The resulting geometry showed the space where the loop has to go through. Subsequently the missing amino acids have been filled in manually. This technique was used to create three different models of MARK which simulate the processs of the loop folding outwards and clearing the entry to the binding site. Inbetween the cavity, the models are very similar. But in the peripheral area where very little contact between loop and the rest of the protein is given differences show up. The comparison of the models with native chrystal structures revealed that the artificial kinases show a different energetic behavior. Instead of reaching lower energy values with every additional amino acid the models exhibit a slight increase which becomes bigger when the loop reaches the outer area of the protein. The theoretical progression of the artificial loops harmonises with the ones seen in native structures of other kinases. Therefore the models can be considered as best possible functional model of MARK. The geometry of the binding site was used to create different linkers between the backbone of the substrate and N9 of Adenine. The organic synthesis leads to two different amino acid analogues (17, 23) which were sucessfully used in solid phase peptide synthesis. The chosen length of the peptides was 13 amino acids because this length fits perfectly with the complete forefront of MARK. Most of the substances didn’t show noteworthy affinities in SPR-studies. In contrast the peptides 55 (repeat 1, 23), 63 (Palladin, 17) and 64 (Palladin, 23) showed a relatively high affinity between 230 (64) and 650 (55) µM towards the kinase. An in vitro assay with radioactive dotated ATP was used as second method to characterise the potential inhibitors. The results differed from the ones of the SPR-experiments. 63 (Palladin, 17) and 66 (Cdc25C V1, 23) showed the ability to reduce the metabolic rate of MARK by 30 %. Though the homologue to 63 (Palladin, 17; 64), which had an even highter affinity in the Biacore-experiments (63: 350 respectively 64: 230 µM) than 63 (Palladin, 17) didn’t show any inhibition here. 66 (Cdc25C V1, 23) as most effective in vitro inhibitor showed no SPR- activity. To get another look on the inhibitory effekt a second version of the assay has been conducted. A special rekombinant substrate allowed the photometric monitoring of the kinase performance. The effective inhibitors 63 (Palladin, 17) and 66 (Cdc25C V1, 23) showed KD- Values of 49 (66) respectively 340 µM (63). But the other peptides which were supposed to show inferiour affinities gave constans between 4.9 (64) and 9.4 (60) µM. The data of three different test procedures led to divergent results. While the SPR-experiment worked with a constant flow and another buffer-system the assays just differed in their substrates. The peptides which had been synthesized with the amino acid analogues 17 and 23 showed definitely inhibitory potential even it differs between the varying tests. Especially the Palladin-based peptides seemed to be effective inhibitors. To get data concerning the specifity of the inhibitory effects which are difficult to characterize a comparison with GSK3β has been conducted. This choice was made because both, MARK and GSK3β, share Tau as target but recognize different phosphorylation-sites. The results were not as promising as anticipated. The effects on GSK3β seemed to be even more intense than the ones on MARK. In summary the concept of design and synthesis of inhibitory peptides could be carried out successfully. Besides different results in the applied test procedures have been observed. The verification of the specifity indicated that the used peptide-sequences did not show the estimated effect of specific binding.