Vergleichende Untersuchungen zur Regulation und Funktion des Adhäsionsmoleküls CEACAM1 in dem extravillösen Trophoblasten der Plazenta und in leukämischen T- Lymphozyten

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden Expression, Regulation und Funktion des Adhäsionsmoleküls CEACAM1 untersucht. Grundlage für diese Untersuchungen war die Beobachtung, dass dieses Adhäsionsmolekül spezifisch von dem Extravillösen Trophoblasten der Plazenta exprimiert wird, d.h. dem Teil, der für das invasive, tumorartige Eindringen der Plazenta in die Gebärmutter verantwortlich ist. Zudem ist eine Dysregulation dieses Proteins bei einer Vielzahl von Tumorentitäten beschrieben. Ziel dieser Promotionsarbeit war deshalb die Untersuchung von CEACAM1 auf Proteinebene mittels Western- Blot und auf Promotorebene mittels Luciferase- Assays, jeweils im Vergleich der „physiologisch“ wachsenden Trophoblastzellen mit einer malignen Tumorzelle, in diesem Fall eine leukämischen T- Lymphozytenklons. Zudem sollte untersucht werden, inwiefern sich eine Mehrinduktion von CEACAM1 auf das invasive Wachstum von Trophoblastzellen auswirkt. Im ersten Teil der Promotionsarbeit wurde die Expression und Stimulierbarkeit von CEACAM1 auf Trophoblastzellen untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die beiden Plazentazellklone über nur eine geringe endogene CEACAM1- Expression verfügten. Diese basale Expression liess sich deutlich steigern durch die Inkubation der Zellen mit TPA (Tetraphorbolester), einem Substrat der Proteinkinase C. Eine weitere Expressionszunahme konnte durch die Zugabe von Ionomycin (Calcium Ionophore) erreicht werden, wobei sich ein maximaler Effekt bei einer Dosis von 0,01μg/ml und einer 24stündigen Inkubationszeit zeigte. Die Stimulation mit Ionomycin alleine hatte jedoch keinen deutlichen Einfluss auf die CEACAM1- Expression. Während eine Stimulation der Zellen mit Estradiol und Dexamethason keinen zusätzlichen Effekt erbrachte liess sich für Progesteron in physiologischen Konzentrationen ein hemmender Einfluss auf die Proteinexpression nachweisen. Diese Ergebnisse liessen sich nur mit Einschränkungen auf die Jurkat- Zellen übertragen. Zwar hatte auch hier TPA bei einer geringen Basalexpression einen steigernden Einfluss auf die CEACAM1- Expression. Die Effekte von Ionomycin und Progesteron konnten hier aber nicht gezeigt werden, Ionomycin hatte in diesem Zellsystem sogar einen eher gegensätzlichen Effekt. Nachdem man auf Proteinebene nachgewiesen hatte, welche Stimulantien die CEACAM1- Expression beeinflussten, wurden im zweiten Teil der Arbeit molekulare Mechanismen dieser Effekte auf Promotorebene untersucht. Zu diesem Zweck wurden unterschiedlich lange Abschnitte des CEACAM1- Promotors auf ihre Basalaktivität und Stimulierbarkeit getestet. Hierbei stellte sich heraus, dass die Basalaktivität der einzelnen Konstrukte zwar mit deren Länge abnahm, jedoch selbst die kleinsten Promotorabschnitte auf die jeweilige Stimulation ansprachen. Bei dem Abgleich der Basensequenz des Promotors fand sich eine Bindungsstelle für die AP-1- Transkriptionfaktoren unmittelbar vor dem Gen. Die Regulation der Aktivität des CEACAM1- Gens durch diese Faktoren könnten das Aktivierungsmuster gut erklären. Die Induktion der Promotoraktivität durch Stimulation mit TPA konnte in beiden Zellsystemen gezeigt werden, während Ionomycin in den Hybridomzellen einen fördernden, in den Jurkat- Zellen einen konzentrationsabhängig hemmenden Einfluss hatte. Ein Einfluss von Progesteron auf die Aktivität des Promotors konnte nicht nachvollzogen werden. Mit Hilfe von „Invasions- Assay“- Kits wurde weiterhin das invasive Potential von Hybridomzellen in Abhängigkeit von der CEACAM1- Expression untersucht. Während die unstimulierten Plazentazellen ein geringes invasives Verhalten aufwiesen, durchwuchsen deutlich mehr Zellen die künstliche Basalmembran, nachdem sie mit TPA vorbehandelt wurden. Analog zu den Western- Blot- Versuchen steigerte sich die Invasivität nach Stimulation mit Ionomycin, während Progesteron einen hemmenden Einfluss hatte. Durch Zugabe eines spezifischen Antikörpers wurde der Nachweis erbracht, dass dieser Effekt massgeblich durch CEACAM1 vermittelt wurde. In der Zusammenschau der Ergebnisse lässt sich festhalten, dass sich die CEACAM1- Expression sowohl in den Plazentazell- Klonen als auch in den malignen Jurkat- Zellen durch die Stimulation von mittels TPA steigern lässt. Ein Unterschied von physiologischer zur pathologischen Regulation lässt sich hierbei nicht ausmachen. Die Muster der Induzierbarkeit von CEACAM1 auf Protein- und auf Promotorebene sprechen am ehesten für eine Aktivierbarkeit des Gens durch den Stoffwechselweg über die Proteinkinase C. Vermittelt wird dieser Effekt vermutlich durch die AP1- Transkriptionsfaktoren, für die sich eine entscheidende Bindungsstelle auf dem CEACAM1- Promotor findet. Die Abweichungen bzgl. der Regulation in den verschiedenen Zellreihen könnten sich am ehesten durch zelltypspezifische Eigenschaften erklären lassen.

Human embryo implantation is a complex process, requiring synchronous development of a receptive endometrium and an activated blastocyst. Cross-communication between maternal and fetal cells is essential for successful implantation. CEACAM1, which is expressed in the extravillous trophoblast (EVT) of the placenta and increases invasiveness of EVT hybridoma cells after transfection with CEACAM1, may also play a role in endometrial/trophoblast interactions. The mechanisms for the implantation and the role of hormones for the expression of CEACAM1 in the utero-placental system are not fully understood. In the present study we investigated for the first time the potential role of TPA and calcium ionophore for CEACAM1 expression and the effect on the invasiveness of placental hybridoma cells using Western blot, luciferase and invasion assays. Treatment with TPA and calcium ionophore A23187 resulted in a strong re-expression of CEACAM1 in trophoblast cells on protein level. Addition of MPA to TPA and calcium ionophore A23187 resulted in a reduction of stimulation. Luciferase reporter assays with CEACAM1 promoter constructs demonstrated that the re-expression of CEACAM1 is regulated at the transcriptional level. In addition, we could show that TPA and ionomycin enhanced the invasiveness of EVT hybridoma cells, which was inhibited through MPA and blocked by monoclonal antibody against CEACAM1. This is the first report demonstrating that activators of AP-1 are able to specifically induce the expression of CEACAM1 in human placental cells and also could be responsible for increasing invasiveness in these cells.