Biotische und abiotische Faktoren der Induktion der Trichothecen-Biosynthese des Weizenpathogens Fusarium graminearum (Schwabe)

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, einen Einblick in die Regulation der Trichothecenbiosynthese des filamentösen Askomyzeten Fusarium graminearum während des Wachstums auf der Wirtspflanze zu erlangen. Es gelang einen Fluoreszenzprotein-Reporterstamm zu klonieren, der sich durch eine konstitutive Expression des rotfluoreszierenden Proteins DsRed und eine TRI5-Promotor getriebene Expression des grünfluoreszierenden Proteins GFP auszeichnet. Somit war es möglich die Induktion der Trichothecenbiosynthese in vivo während des Verlaufs der Infektion auf Weizenähren zu verfolgen und durch Fluoreszenzmikroskopie zu dokumentieren. Zusätzlich zu diesen in vivo-Versuchen konnte ein Induktionsassay etabliert werden, indem Minikulturen in 96-Lochplatten unter verschiedenen Bedingungen und unter dem Einfluss unterschiedlicher Substanzen angezogen und auf die Induktion des TRI-Genclusters untersucht wurden. Während des Wachstums auf der Pflanze zeigte sich eine sehr starke Induktion des TRI5Prom::GFP-Stammes in der Karyopse und im Rachisknoten. Dieser Bereich reagiert mit der Bildung von Zellwandverdickungen auf den Befall mit einer Toxin-defizienten tri5-Mutante, wodurch diese in der inokulierten Ähre zurückgehalten wird. Die sehr hohe Induktion von TRI5 in diesem Bereich deutet auf eine Antwort des eindringenden Reporterstammes auf die pflanzlich induzierte Abwehr hin. Die Proteinbiosynthese-inhibierenden Eigenschaften des pilzlichen Toxins Deoxynivalenol könnten wiederum die Pflanzenabwehr unterdrücken und so F. graminearum ermöglichen, die Ähre zu besiedeln. Die in den Induktionsassays getesteten Phenylpropanoidsäuren erwiesen sich nicht als Induktoren der Trichothecenbiosynthese, sondern inhibierten stark das Wachstum des Pilzes. Bis auf ammoniumhaltige Salze erwiesen sich alle anderen getesteten Komponenten ebenfalls als nicht relevant für die Induktion der TRI5-Expression. Durch die Isolierung von Rohextrakten aus infizierten Rachisknoten und deren Verwendung in den Induktionsassays konnte gezeigt werden, dass der TRI5-induzierende Faktor de novo durch die Pflanzenabwehr gebildet wird. In HPLC/MS-Messungen konnte jedoch lediglich eine erhöhte Konzentration des Lignin-Vorläufers p-Cumarinsäure eindeutig identifiziert werden. Neben diesen Rohextrakten konnte auch mit den alkoholischen Extrakten aus Weizen- und Maismehl eine sehr hohe Induktion der Trichothecenbiosynthese in den Induktionsassays nachgewiesen werden. Bei diesen Extraktionen wurden die in wässrigem Alkohol löslichen Speicherproteine aufkonzentriert. Diese zeichnen sich in ihrer Aminosäurezusammensetzung durch einen besonders hohen Anteil an Glutamin und Glycin aus. Die Induktion der Trichothecenbiosynthese durch Ammoniumsulfat als auch durch diese Aminosäuren ergab den Hinweis, dass die Toxinproduktion in F. graminearum abhängig von der verfügbaren Stickstoffspezies reguliert wird. Kulturen des Reporterstammes auf Agarplatten, deren einzige Stickstoffquelle Ammonium war, zeigten ebenfalls eine sehr starke Induktion des TRI5Promotor-GFP-Konstruktes. Wurde Nitrat als Stickstoffquelle eingesetzt, kam es dagegen nicht zu einer Induktion der Toxinproduktion. Neben der Induktion der Toxinproduktion durch Ammonium zeigte sich auch ein stark verändertes Hyphenwachstum. Das Myzel war in seinem Längenwachstum deutlich eingeschränkt und wies eine sehr starke Verzweigung der einzelnen Hyphen auf. Durch die Zugabe des Glutamin-Synthetase-Inhibitors L-Methionin-DL-Sulfoximin konnte sowohl die TRI5-Expression und Toxinproduktion herabgesetzt als auch das eingeschränkte Hyphenwachstum rückgängig gemacht werden. Dies deutet auf eine mögliche sensorische Aktivität der Glutamin-Synthetase und einen direkten Einfluss dieses Enzyms auf die stickstoffabhängige Regulation von Genen in F. graminearum hin. Diese Arbeit kann zum ersten Mal nachweisen, dass ein Virulenzfaktor von F. graminearum durch die Verfügbarkeit der bevorzugten Stickstoffquelle Ammonium induziert wird. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Regulation der Virulenzfunktionen in F. graminearum ähnlich zu den bekannten Regulationsmechanismen in F. oxysporum und F. fujikuroi ist.