Früherkennung von Vorstufen des kolorektalen Karzinoms: Identifizierung und Charakterisierung potentieller Tumorbiomarker

Abstract

Darmkrebs ist in vielen Industrieländern bei beiden Geschlechtern die zweithäufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste Todesursache unter den Krebs-erkrankungen. Eine Entwicklung neuer, nicht invasiver Früherkennungsmethoden würde die Akzeptanz von Früherkennungsmaßnahmen weiter verbessern und zudem Kosten für aufwendige Koloskopien sparen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue Biomarkerkandidaten zur Früherkennung des kolorektalen Karzinoms, insbesondere der benignen Vorstufen, den Adenomen, zu entdecken und zu identifizieren. Mit Hilfe der SELDI-TOF MS-Technologie wurden in zwei unabhängigen Untersuchungen unter standardisierten Bedingungen Serumproben von Patienten mit kolorektalen Adenomen und Karzinomen (Stadium III) sowie Patienten ohne Tumorerkrankung (Kontrollgruppe) analysiert. Zwei Biomarkerkandidaten mit hoher Signifikanz konnten als C3a-desArg und Transthyretin identifiziert werden. Beide Proteine zählen zu den Akute-Phase-Reaktanten. Die anschließende Validierung mit antikörperbasierten Methoden bestätigte ihr Potential, als Biomarker zur Früherkennung kolorektaler Adenome und Karzinome zu dienen. Mit der Kombination beider Biomarkerkandidaten konnte eine Sensitivität von 96% bei einer Spezifität von 70% erzielt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Gewebeproben von Adenomen und Karzinomen (Stadium III) sowie dem korrespondierenden Normalgewebe mit Hilfe der SELDI-TOF MS-Technologie untersucht. Ziel war es, durch die Untersuchung von Gewebe noch spezifischere Biomarker zu entdecken. Zu den interessantesten Kandidaten zählte ein Protein mit m/z 10324 ± 10, dessen Level einen deutlichen Anstieg von Normal- zum Adenomgewebe und weiter zum Karzinomgewebe zeigte (p < 0,001). Dieser Biomarkerkandidat konnte als N-terminales Fragment des Proteins GRP94 identifiziert werden, einem konstitutiv exprimierten und durch Stressbedingungen induzierbaren Chaperon des endoplasmatischen Reticulums. Wie die Analyse von mikrodissektierten Gewebekompartimenten zeigte, scheint das N-terminale Fragment von den Epithelzellen des Tumorgewebes gebildet zu werden. Spezifische Antikörper waren erforderlich, um einerseits die proteolytische Spaltung des GRP94 unter Entstehung des N-terminalen Fragmentes näher zu untersuchen und andererseits eine Validierung und eine Analyse des Serums durchführen zu können. Für die Generierung solcher Antikörper mit Hilfe der HuCAL® Technologie wurde das N-terminale GRP94-Fragment in E.coli rekombinant exprimiert und mit Hilfe des N-terminalen Polyhistidin-Tags gereinigt. GRP94 konnte aus Zellen einer Kolonzelllinie aufgereinigt werden. Leider gelang es nicht, spezifische Antikörper zu generieren, um das GRP94-Fragment als Tumorbiomarker zu validieren und weiter zu charakterisieren. Ein weiterer interessanter Biomarkerkandidat mit m/z 4837 ± 5 wies nur im Adenomgewebe erhöhte Level auf. Im Karzinomgewebe konnten im Vergleich zum Normalgewebe keine Intensitätsunterschiede detektiert werden.

Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit Hilfe hochqualitativer Proben und moderner Technologien potentielle Tumorbiomarker zur Früherkennung des kolorektalen Karzinoms identifiziert werden. In weiteren Studien sollte nun mit großen heterogenen Gruppen die Validierung der Biomarkerkandidaten erfolgen, um in Zukunft eine klinische Anwendung zu ermöglichen.

In many industrial countries, intestinal cancer is the second most common cancer in men and women and the second most frequent cause of death among cancer diseases. A development of new, non-invasive early detection methods would continue to improve the acceptance of early detection measures and would furthermore save costs for complex colonoscopies. The aim of the present dissertation was to discover and identify new biomarker candidates for the early detection of colorectal carcinoma, particularly of benign precursors: the adenomas. In two independent analyses under standardised conditions, sera samples of patients with colorectal adenomas and carcinomas (stage III) as well as of patients without cancer (control group) were analysed using SELDI-TOF MS technology. Two biomarker candidates with high significance could be identified as C3a-desArg and transthyretin. Both proteins are among the acute phase reactants. The subsequent validation using antibody-based methods confirms their potential to be used as biomarkers for the early detection of colorectal adenomas and carcinomas. With the combination of both biomarker candidates, a sensitivity of 96% in combination with a specificity of 70% could be achieved. In the second part of the work, tissue samples of adenomas and carcinomas (stage III) as well as of the corresponding normal tissues were examined using SELDI-TOF-MS technology. The aim was to discover even more specific biomarkers by examination of the tissues. One of the most interesting candidates was a protein with m/z 10324 ± 10, whose level significantly rose from normal to adenoma tissue and further to carcinoma tissue (p < 0.001). This biomarker candidate could be identified as N-terminal fragment of the protein GRP94, representing a chaperone of the endoplasmic reticulum, which is constitutively expressed and induced under stress conditions. The analysis of microdissected tissue compartments showed that the N-terminal fragment seems to be expressed by the epithelial cells of the tumour tissue. Specific antibodies were necessary, on the one hand, to examine the proteolytic cleavage of GRP94 more closely, which results in the N-terminal fragment, and, on the other, to carry out a validation and an analysis of the sera. For the generation of such antibodies using the HuCAL® technology, the N-terminal GRP94 fragment was recombinantly expressed in E.coli and purified using an N-terminal polyhistidine tag. GRP94 could be purified from cells of a colon cell line. Unfortunately, it failed to generate specific antibodies in order to validate and further characterise the GRP94 fragment as a tumour biomarker. Another interesting biomarker candidate with m/z 4837 ± 5 showed increased levels only in the adenoma tissue. No differences in intensity could be detected between the carcinoma tissue and the normal tissue.

Within the scope of this work, potential tumour biomarkers for the early detection of colorectal carcinoma could be identified using high-quality samples and modern technologies. In further studies, the biomarker candidates should now be validated using large, heterogeneous groups in order to allow clinical application in the future.