Mechanismen der rezeptorabhängigen Endozytose von Liganden : Untersuchungen am nclf-Mausmodell (Mus musculus, Linneaus 1758) der varianten Form spät infantiler Neuronaler Ceroid-Lipofuszinose

Abstract

Die neuronalen Ceroid-Lipofuszinosen (NCL) umfassen eine Gruppe neurodegenerativer, lysosomaler Speichererkrankungen im Kindesalter, denen bisher neun CLN-Gendefekte zugrunde liegen. CLN6 kodiert für ein nicht-glykosyliertes, ER-residentes, polytopes Transmembranprotein unbekannter Funktion, das ubiquitär exprimiert wird. Defekte im CLN6-Protein, die die spätinfantile variante Form der NCL verursachen, führen zu einer veränderten Endozytose von lysosomalen Enzymen und spezifisch zum Absterben neuronaler Zellen über unbekannte Mechanismen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss verschiedener krankheitsrelevanter Mutationen im CLN6-Gen auf die Stabilität, den Abbau, die Dimerisierung und die Lokalisation der mutierten Proteine untersucht. Die Expressionsanalyse zeigte, dass mutierte CLN6-Proteine verringerte Halblebenszeiten aufweisen und vorzeitig durch Proteasomen und lysosomale Hydrolasen abgebaut werden. Diese Abbauwege sind ausreichend, um die Akkumulation und Aggregation der mutierten CLN6-Polypeptide im ER und das Auslösen von ER-Stress zu verhindern. Doppelimmunfluoreszenz-Mikroskopie und Crosslink-Analysen zeigten, dass mit Ausnahme der Mutante CLN6 p.R106PfsX26 keine der untersuchten CLN6-Mutanten in der intrazellulären Lokalisation oder im Dimerisierungsverhalten verändert sind. Zum anderen zeigten Transportanalysen an neuronalen Zellen aus Wildtyp- und nclf-Mäusen, einem natürlichen Tiermodell der humanen CLN6-Krankheit, dass die Internalisierung verschiedener Liganden (Transferrin oder die lysosomale Arylsulfatase B (ASB)) und Cargo-Rezeptoren (ubiquitinylierte CD4-Rezeptorchimären) vermindert sind. Diese Ergebnisse konnten in CLN6 siRNA transfizierten Zellen bestätigt werden. Als molekulare Ursachen wurden Veränderungen der Membranzusammensetzung, wie erhöhte Spiegel des Phosphatidylinositolphosphats PI(3,4,5)P3 und Cholesterin, sowie die Reduktion und Umverteilung der GTPase RAB4 nachgewiesen. Dabei aktiviert PI(3,4,5)P3 möglicherweise den AKT-Signalweg, über den die Cholesterinsynthese gesteigert werden kann. Überraschenderweise zeigten Aufnahmestudien mit Fluorophor- oder [125I]-markierter ASB an kultivierten neuronalen Zellen der Maus, dass die Sulfatase in RAB5-positiven frühen endosomalen Strukturen akkumuliert und LAMP1-positive Lysosomen nicht erreicht. Die Lokalisationsaufnahmen wurden biochemisch durch die fehlende proteolytische Reifung der ASB, die nur in den Lysosomen erfolgen kann, bestätigt. In murinen Astrozyten waren der Transport zu den Lysosomen und die Prozessierung der internalisierten ASB jedoch nachweisbar. Die Daten zeigen, dass die Mutationen in CLN6 zu reduzierten Halblebenszeiten der Proteine führen, die im schnellen Abbau begründet liegen. Veränderungen im Phosphatidylinositolphosphat- und Cholesterinstoffwechsel beeinflussen die Zusammensetzung von Membranen neuronaler Zellen so, dass sekundär Transportwege verschiedener Rezeptoren zwischen Plasmamembran und Lysosomen, sowie Sortierungsprozesse in Endosomen gestört sind. Eine mögliche Beteiligung von CLN6 an der Regulation der Cholesterin-Homöostase ist Gegenstand weiterführender Untersuchungen.