Charakterisierung von Interleukin 6 Rezeptor-spezifischen Aptameren

Abstract

Der humane IL-6-Rezeptor (IL-6R) wird über das Zytokin IL-6 stimuliert, der nicht nur in Entzündungsreaktionen involviert ist, sondern ebenfalls in der Regulation von endokrinen und metabolischen Funktionen eine wichtige Rolle spielt. Die Dysregulation dieses multifunktionalen Zytokins wird in Zusammenhang mit diversen Erkrankungen wie Osteoporose oder rheumatoider Arthritis gebracht. Die Bindung des Zytokins IL-6 an IL-6R-tragende Zellen führt zu einer Assoziation mit dem Signalüberträger gp130. Der IL-6R und gp130 unterliegen Recyclingprozessen, in denen eine Translokation in das Zellinnere stattfindet. Dieser als Internalisierung bezeichnete Mechanismus stand im Fokus dieser Arbeit. Die Verwendung von DNA- und RNA-Aptameren, die hoch affin und spezifisch an den IL-6R binden konnten, sollten zur zellspezifischen Wirkstoff-übertragung eingesetzt werden. Der Einsatz von fluoreszenzmarkierten Aptameren ermöglichte die Zytokin-unabhängige Internalisierung in IL-6R-tragende Zellen durchflusszytometrisch zu untersuchen, als auch mikroskopisch zu verifizieren und zu visualisieren. Ein Konstrukt, das mittels der Konjugation von Streptavidin-Biotin-Derivaten hergestellt wurde, setzte sich aus dem IL-6R-bindenden Aptamer und Fluorophor zusammen. Die zellspezifische Internalisierung konnte ebenfalls für dieses Konstrukt nachgewiesen werden. Dies eröffnete die Möglichkeit, der Fluorophor durch alternative Substanzen wie siRNAs auszutauschen, um über den RNA-Interferenz-Mechanismus gezielt Gene zu regulieren. Erste Versuche bei der Verwendung einer siRNA gegen PLK1 scheiterten. Eine Optimierung der Konstruktion der siRNA sollte hier angestrebt werden. Andererseits wurde die direkte Kopplung der IL-6R-bindenden RNA-Aptamere mit Proteinen angestrebt. Die kovalente Bindung des RNA-Aptamers mit dem Toxin Gelonin konnte mit dem Crosslinker Sulfo-SMCC umgesetzt werden. In einer Aptamer-vermittelten Internalisierung beeinflusste das Aptamer-Toxin-Konjugat nicht die Proliferation IL-6R-tragender Zellen. Hierbei könnte eine reversible Thiolbindung, die zur Toxinabspaltung im Inneren der Zelle führen würde, den Schlüssel zum Erfolg darstellen. Das DNA-Aptamer hingegen konnte aufgrund einer raschen Dissoziation vom IL-6R nicht an die Zellen binden. Es gelang durch Konstruktion eines Aptamer-Dimers die Dissoziation derart zu verlangsamen, dass die spezifische IL-6R-Bindung sowie die Internalisierung nachgewiesen werden konnte. Dieses DNA-Dimer könnte ebenfalls im Fokus zur zellspezifischen Wirkstoffübertragung dienen.

The human IL-6-receptor (IL-6R) is stimulated by the cytokine IL-6. It is involved in inflammatory reactions as well as in regulation of endocrinal or metabolic mechanisms. Dysregulation of the multifunctional cytokine IL-6 is associated with diverse diseases such as osteoporoses or rheumatoid arthritis for instance. Binding of the cytokine IL-6 to its receptor leads to association with the signal transducer gp130. Both, IL-6R and gp130 are subjected to recycling processes which causes a translocation into the cell. In this thesis the focus was on this mechanism named internalization. Cell-specific RNA and DNA aptamers were used offering the ability to bind to the IL-6R. Cell-specific Aptamer-mediated drug delivery was primarily targeted. The usage of fluorescing aptamers allowed to analyze the cytokine independent internalization into IL-6-producing cells by flow cytometry and fluorescence microscopy. Constructs were generated by assembling statistically three biotinylated aptamers and one fluorophore via a Streptavidin platform. The cell-specific internalization of these constructs could be demonstrated. This result affords the opportunity to replace the fluorophore by other substances like siRNAs for gene regulation by RNA interference. First attempts to use a siRNA targeting PLK1 failed. Constructing a more effective siRNA-conjugate should be obtained. On the other hand direct coupling of the RNA aptamer with the toxic protein gelonin could be achieved by crosslinking reaction with Sulfo-SMCC. But the aptamer-mediated internalization of the aptamer-gelonin-construct did not influence IL-6R cell proliferation. In this case a reversible thiol bond which leads to a separation inside the cell could be a possible solution. However, the DNA Aptamer was not able to bind on IL 6R cells due to a relatively fast dissociation from the IL-6R. Overcoming these difficulties the aptamer was dimerizied generating a construct which was able to bind and internalize into IL-6R cells. This aptamer could also be used for cell-specific aptamer-mediated drug delivery.