Bedeutung der Proteinkinasen PINK1 und MARK2 für die Funktion von Mitochondrien in neuronalen Zellmodellen

Abstract

Die Proteinkinase MARK2 wird vor allem in Zusammenhang mit der Alzheimerschen Krankheit untersucht. Die wichtigste Funktion ist dabei die Regulation des Auf-, Ab- und Umbaus des Zytoskelettes. Die Mikrotubuli werden von dem Protein Tau stabilisiert, solange dieses an sie gebunden ist. Soll ein Umbau der zellulären Struktur erfolgen, ist das Ablösen des Tau Proteins von den Mikrotubuli erforderlich und wird durch Phosphorylierung von Tau durch MARK2 bewerkstelligt. Um neue Regulationspartner für MARK2 zu identifizieren, wurde vor Beginn dieser Arbeit ein Hefe-2-H-Screen durchgeführt. Dabei wurde eine Interaktion mit der Proteinkinase PINK1 entdeckt (Matenia et al. 2011, eingereicht). Die Bindung dieser beiden Kinasen ist die Grundlage der vorliegenden Arbeit. Die Proteinkinase PINK1 ist besonders für die Erforschung der Parkinson Erkrankung von Interesse. Ihr wird eine große Bedeutung für die Mitochondrienfunktion zugeschrieben. So wurde bereits gezeigt, dass PINK1 Zellen vor stress-induzierter Apoptose schützt, einen Einfluss auf die Zellatmung und Ca2+-abhängige Signalwege hat, wichtig ist für Mitophagie, Teilung und Verschmelzung der Mitochondrien, sowie für den Mitochondrientransport (zusammengefasst in Deas et al. 2009). Folgende Fragen werden PINK1 betreffend aktuell diskutiert: Erstens ist noch nicht vollständig geklärt, ob PINK1 ein intramitochondriales Protein ist, oder ob es sich auf der Mitochondrienoberfläche befindet. Zweitens wird gezeigt, dass PINK1 in mehreren Spaltprodukten vorliegt, wobei hier unklar ist, ob es innerhalb oder außerhalb des Mitochondriums geschnitten wird und welche Funktionen die Spaltprodukte haben. Nachdem eine direkte Interaktion zwischen MARK2 und der Kinasedomäne von PINK1 in einem direkten Hefe-2-H-Test, sowie auch in Koimmunopräzipitationen nachgewiesen werden konnte, sollten die Auswirkungen dieser Interaktion näher betrachtet werden. In Kinaseassays zeigte sich, dass es sich bei MARK2 um den ersten identifizierten vorgeschalteten Regulator von PINK1 handelt. Die genauere Analyse der MARK2-Phosphorylierungsstelle in PINK1 ergab zudem, dass es sich bei dieser um die bekannte Parkinson-Mutationsstelle T313 handelt. Es kann daher angenommen werden, dass beide Kinasen eine Bedeutung für die Ausbildung der neurodegenerativen Erkrankung Parkinson haben. Obwohl MARK2 eine zytosolische Kinase ist, konnte in Kolokalisations- und Fraktionierungsexperimenten eine Assoziation mit Mitochondrien gezeigt werden. Als mögliche Funktion der MARK2-PINK1-Interaktion erschien ein Einfluss auf den mitochondrialen Transport als naheliegend, da sowohl für MARK2 als auch für PINK1 bereits ein direkter Einfluß auf den Mikrotubuli-assoziierten Transport nachgewiesen wurde. MARK2 reguliert den Kinesin-assoziierten Transport entlang der Mikrotubuli durch die Phosphorylierung von Tau. Dadurch wird Tau von den Mikrotubuli abgelöst und das Anheften von Kinesin ermöglicht (Mandelkow et al. 2004). PINK1 wiederum ist Teil des mitochondrialen Transportkomplexes. (Weihofen et al. 2009). Daher wurden Transportstudien der Mitochondrien mittels Echtzeit-Mikroskopie von Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass das 45 kDa PINK1-Fragment am anterograden Transport der Mitochondrien beteiligt ist. Seine Funktion liegt vor allem darin, den mitochondrialen Transport zu stoppen, wobei MARK2 diesen Effekt verstärkt. Hingegen begünstigt das vollständige PINK1-Protein den retrograden Transport von Mitochondrien und wird hierbei von MARK2 unterstützt. Im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit sollten über das Hefe-2-H-System weitere PINK1-Interaktionspartner identifiziert werden. Ein für die Mitochondrienfunktion bedeutender Interaktionspartner stellte hierbei die Untereinheit 5B der Cytochrom-c-Oxidase dar. Es sollte untersucht werden, ob COX5B von PINK1 phosphoryliert wird und ob die PINK1-MARK2 Interaktion dabei eine Rolle spielt. Dabei ergab sich, dass entgegen der Erwartung MARK2 COX5B phosphoryliert und PINK1 diese Phosphorylierung hemmt. Abschließende biochemische Untersuchungen der Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität zeigen ebenfalls einen aktivierenden Einfluss von MARK2, wohingegen sich PINK1 negativ regulatorisch auswirkt. Insgesamt zeigen die Ergebnisse neue Mechanismen auf, welche das Verständnis des mitochondrialen Transportes und der mitochondrialen Atmung erweitern. Es wird in dieser Arbeit deutlich, wie wichtig eine genaue Regulation der beiden Kinasen PINK1 und MARK2 für die Zellvitalität ist. Durch die Interaktion der beiden Kinasen kann außerdem eine Verbindung zwischen den neurodegenerativen Erkrankungen Alzheimer und Parkinson hergestellt werden. Dadurch leistet diese Arbeit auch einen Beitrag zur Aufklärung der Ursachen dieser Krankheiten.

The kinase MARK2/Par-1 plays key roles in several cell processes, including neurodegeneration such as Alzheimer disease by phosphorylating tau and detaching it from microtubules. In search of interaction partners of MARK2, we identified phosphatase and tensin homolog (PTEN)-induced kinase 1 (PINK1), which is important for the survival of neurons and whose mutations are linked to familial Parkinson disease (PD). MARK2 phosphorylated and activated the cleaved form of PINK1 (NPINK1; amino acids 156–581). Thr-313 was the primary phosphorylation site, a residue mutated to a non-phosphorylatable form (T313M) in a frequent variant of PD. MARK2 and PINK1 were found to colocalize with mitochondria and regulate their transport. N-PINK1 promoted anterograde transport and increased the fraction of stationary mitochondria, whereas fulllength PINK1 promoted retrograde transport. In both cases, MARK2enhanced the effects. The results identifyMARK2as an upstream regulator of PINK1 and N-PINK1 and provide insights into the regulation of mitochondrial trafficking in neurons and neurodegeneration in PD.